TNF-α、IL-6、IL-8在 Modic I型改變腰椎終板與椎間盤髓核中的表達及關系研究

莊汝杰 陳冠軍 莊偉 陳揚 童培建

TNF-α、IL-6、IL-8在 Modic I型改變腰椎終板與椎間盤髓核中的表達及關系研究

莊汝杰 陳冠軍 莊偉 陳揚 童培建

目的 探討腰椎Modic I型改變的腰椎終板與椎間盤髓核中TNF-α、IL-6、IL-8的相關性。方法收集30例因下腰痛入院手術治療并行腰椎MRI檢查確認為腰椎Modic I型改變患者的術中病灶椎間盤標本，進行免疫組化檢測，并觀察椎間盤組織病理變化及炎癥因子的表達，IL-6、IL-8相對表達水平以相對表達量△Ct或（2-△Ct×104）進行分析。結果Modic I型終板中TNF-α表達水平（9．2±0．7）高于髓核（7．2±0．5），差異有統計學意義（P＜0．05）；髓核中△Ct IL-6、△Ct IL-8相對表達量（6．34±1．82、10．62±1．88）高于終板（4．07±1．86、5．92±1．31），差異均有統計學意義（均P＜0．05）。結論Modic I型終板中TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平明顯高于髓核，其引起下腰痛的原因主要為終板的炎癥改變。

Modic I型 炎癥因子 腰椎間盤 終板

腰椎Modic改變是美國放射科醫師Modic在20世紀80年代首先發現并命名的，現認為Modic I型為炎癥水腫期。近年來，筆者共收集30例因下腰痛而行手術治療的Modic I型患者的病變椎體終板和髓核，檢測其TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平并探討兩者表達水平差異的關系，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2011年6月至2012年12月浙江中醫藥大學附屬第一醫院收治的30例Modic I型改變的慢性下腰痛患者，其中男12例，女18例；年齡43～69歲，平均（54.13±6.35）歲。患者病史9～20個月，平均（12.32±2.13）個月；臨床表現：右下肢小腿外側及足背麻木9例，右下肢小腿內側麻木3例，左下肢小腿外側及足背麻木8例，左下肢小腿內側麻木2例，伴有間歇性跛行8例；影像學檢查結果提示病變部位L3～L4節段12例，L4～L5節段18例，均為單一節段病變，且局部存在神經壓迫或椎管狹窄；患者腰椎MRI檢查結果由2位高年資骨科醫師進行獨立雙盲分析后認為屬于腰椎終板變化中的Modic I型改變的患者。手術采用腰椎后路手術，根據患者實際情況選擇融合或非融合。

1.2 方法 手術取出病變椎體的髓核和終板組織送病理檢查做成石蠟切片，并行TNF-α、IL-6和IL-8免疫組化染色，顯微鏡下觀察結果：在細胞質或核內出現黃、棕色顆粒為陽性。免疫組化半定量計分方法[1]：首先根據染色強度評分，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色深淺需與背景著色相對比，再將陽性細胞所占的百分比評分，0分為陰性，1分為陽性細胞＜10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分，免疫反應(+)。再將手術時所采取的椎間盤髓核、終板組織，放入凍存管中，置于-80℃超低溫冰箱中凍存備用，行實時熒光定量RT-PCR檢測。采用Primer 5.0引物設計軟件和引物設計原則進行PCR引物的設計，然后由上海生物工程有限公司負責合成，序列見表1。cDNA合成操作步驟（可參考TAKARA RT試劑盒）：（1）短暫離心后，加入如下組分：5×第一鏈反應緩沖液2μ1、Oligo dT引物0.5μl逆轉錄酶0.5μl，總RNA 2μl，取DEPC水補齊到10 μl；（2）輕輕混勻后，混合物在37℃中放置20min；（3）85℃加熱15s終止反應，至冰上進行后續試驗或冷凍保存。各個目的基因的相對表達水平以相對表達量△Ct或（2-△Ct×104）進行分析（注：△Ct數值大，說明組織表達量反而低）。

表1 GAPDH、IL-6、IL-8、PGE-2引物序列產物及Tm值

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

ModicⅠ型終板中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8分別為9.2±0.7，4.07±1.86，5.92±1.31，髓核中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8分別為7.2±0.5，6.34±1.82,10.62± 1.88，終板中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8與髓核比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），即終板中的TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平明顯高于髓核。

3 討論

TNF-α、IL-6、IL-8均屬于炎癥過程中炎癥介質的細胞因子類。此外，TNF-α亦屬于腫瘤壞死因子超家族成員，是一種主要由激活的巨噬細胞分泌的能夠抑制成骨細胞和刺激破骨細胞作用的炎癥介質，其在炎癥過程中發揮重要作用，通過調節細胞增殖和凋亡，實現對腫瘤細胞的細胞溶解、抑制增殖、誘導凋亡過程，且影響多種正常細胞的生長分化，并通過改變內皮細胞基因表達激活內皮細胞產生其他炎癥介質（如IL-1、IL-6、IL-8、CSF等）。TNF-α參與炎癥反應的全部過程，在炎癥局部血管通透性增加、白細胞附壁、滲出和致病因子消除等過程中均起到促進作用,TNF-α可引起發熱、外周血中白細胞改變等，故有學者將其稱為“廣譜炎癥介質”[2]。許多學者研究證明，TNF-α水平在腰椎間盤退化癥的患者中較高[3-7]。IL-6、IL-8均屬于主要由單核-巨噬細胞分泌的細胞因子，其中IL-6作為一種多效應的細胞因子，對細胞的生長、分化甚至基因表達都有影響，并且作為重要的炎癥遞質在退行性骨病發病中發揮重要作用，其介導B細胞的進一步分化，刺激肝細胞合成急性期蛋白，促進免疫球蛋白的合成、分泌，增強體液免疫功能，參與炎癥反應。此外，IL-6作為炎癥反應催化劑，可刺激炎性細胞聚集、激活和炎性遞質的釋放，促進腰椎間盤退變的炎癥過程。IL-8則主要通過吸引和激活中性粒細胞，從而導致機體局部的炎癥反應。

本研究結果發現，ModicI型病變椎體中終板TNF-α的表達水平明顯高于髓核，終板組織中△Ct IL-6、△Ct IL-8值明顯低于髓核組織，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。相對表達量越高，說明表達量反而越低，終板IL-6、IL-8的表達水平比髓核的更高，表明炎癥在終板中的程度較髓核更為明顯。

本研究結果明確了終板在Modic I型改變中的重要性，這將對臨床治療具有指導意義；但是本研究也存在一些不足之處，譬如：由于樣本數量較少，或許不能全面地、準確地反映炎癥因子在Modic I型改變中的作用；研究的時間太短，不能全面地反映出整個疾病發展的過程。今后應增加收集的病例數，延長隨訪，進一步亞組分析研究。

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ObjectiveTo investigate the expression of TNF-α,IL-6 and IL-8 in lumbar vertebral nucleus pulposus and end plate tissue in patients with Modic type I changes．MethodsThirty patients with low back pain and MRI-confirmed lumbar end-plate Modic type I changes underwent surgical treatment．The disc specimens were collected in the surgery and examined with Immunohistochemistry for expression of TNF-α,IL-6 and IL-8．The association of pathological changes of intervertebral disc tissue with the expression of TNF-α,IL-6,IL-8 and the relative expression of Ct or(2-△Ct×104)was analyzed．ResultsThe expression level of TNF-α in lumbar end plates was higher than that in nucleus pulposus(9．2±0．7,7．2±0．5,P＜0．05); while the expressions of IL-6 and IL-8 in nucleus was higher than those in end-plate(6．34±1．82,4．07±1．86 and 10．62±1．88, 5．92±1．31,respectively,P＜0．05)．ConclusionThe expression of inflammatory factors in lumbar endplate were above that of nucleus．The low back pain was caused by the inflammation changes in lumbar end plate．

Modic I type Inflammatory factorLumbar intervertebral disc Lumbar end plate

2014-11-13）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省自然基金資助項目（Y2110746）

310006 杭州，浙江中醫藥大學附屬第一醫院骨傷科（莊汝杰、陳冠軍、陳揚、童培建）；杭州市蕭山區中醫院骨傷科（莊偉）

莊汝杰，E-mail：rujiezhuang@163.com