枳殼揮發油包合工藝的優化

付立娟，高 陸，蘇 婷，牛耀祥，邊 雨，吳詩藝

(1.長春中醫藥大學，吉林長春130117;2.修正藥業集團新藥開發有限公司，吉林長春130012)

枳殼始載于《雷公炮炙論》，為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實。枳殼揮發油具有促進胃排空和加快腸蠕動，對CaCl2、Ach及磷酸組織胺引起的痙攣性收縮有明顯的松弛作用，且能減少胃酸量及對抗大鼠幽門結扎性潰瘍的形成。枳殼揮發油中主要成分是檸檬烯。臨床上，檸檬烯具有抗腫瘤、治療膽囊炎等作用。另外，揮發油中另一重要成分芳樟醇，具有防腐、抗菌、抗病毒和鎮靜等作用［1］。

將枳殼揮發油制備成β-環糊精包合物，多數學者測定揮發油包合率的方法基本均為水蒸氣再蒸餾包合物法重回收揮發油計算包合率，且測定揮發油多用氣相色譜法［2］，而該試驗采用HPLC法測定揮發油中檸檬烯的含量，計算揮發油包合物，為枳殼揮發油包合率的測定提供高效、簡便、精確的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 安捷倫高相液相色譜儀;島津 UV-2401PC紫外可見分光光度計;超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 試劑試藥 枳殼購自石家莊市誠信中藥材有限公司;色譜甲醇;分析甲醇(北京化工);無水乙醇(北京化工);檸檬烯標準品(上海源葉生物科技有限公司，純度為98%，批號YF0225SA14)。

1.3 試驗方法

1.3.1 枳殼揮發油的提取。稱取適量枳殼藥材，粉碎成最粗粉，加4倍量水，連接揮發油提取裝置，加熱回流提取至揮發油不再增加時(約4 h)，停止加熱，放置0.5 h，收集揮發油，用無水硫酸鈉脫水干燥，備用。

1.3.2 揮發油包合方法。采用研磨法包合揮發油，取一定量的β-環糊精，將揮發油用適量無水乙醇溶解，緩緩加入β-CD中，邊加邊研磨，再緩慢加入相當于β-環糊精3倍量的水研磨成糊狀，持續研磨一定時間后，適當溫度烘干，將干包合物研磨成細粉，即得［3］。

1.3.3 包合物中揮發油含量的測定。

1.3.3.1 高效液相色譜條件。色譜柱為ACE-C18(4.6 mm×50 mm，1.8 μm)，以甲醇 - 水(75∶25)為流動相，流速1 ml/min，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃［4-5］。

1.3.3.2 對照品溶液的制備。精密稱取檸檬烯對照品0.076 0 g，置于 50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，搖勻，即1.489 6 mg/ml。精密移取上述溶液5 ml，置于50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，搖勻，過濾，即得。

1.3.3.3 揮發油樣品的制備。精密吸取揮發油0.5 ml，置于5 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，搖勻。精密吸取1 ml置50 ml容量瓶，甲醇定容，搖勻。精密吸取1 ml置10 ml容量瓶，甲醇定容，搖勻，即得。

1.3.3.4 供試品溶液的制備。取 β -CD 包合物0.1 g，精密稱定，置于25 ml容量瓶，加入甲醇20 ml，超聲處理30 min，取出，放置至室溫，甲醇定容，搖勻，過濾，即得。

1.3.3.5 檢測波長的確定。取“1.3.3.2”項下制備的對照品溶液，以甲醇為空白，采用紫外可見分光光度法在200～400 nm波長范圍內進行波長掃描。

1.3.4 方法學考察。

1.3.4.1 線性關系考察。分別精密吸取0.149 0 mg/ml的對照品溶液2、6、10、14、18 μl，按“1.3.3.1”色譜條件進樣。以峰面積Y為縱坐標、進樣體積為橫坐標，繪制檸檬烯對照品的標準曲線。

1.3.4.2 精密度試驗。取0.149 0 mg/ml的對照品溶液，進行精密度試驗，按“1.3.3.1”色譜條件操作，連續進樣6次，測定峰面積并計算RSD值。

1.3.4.3 穩定性試驗。取“1.3.3.4”項下制備的供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10、15、20、25 h 進樣，通過測定峰面積，計算RSD值。

1.3.4.4 重現性試驗。取同一批枳殼揮發油包合物6份，每份0.1 g，精密稱定，按“1.3.3.4”項制備供試品溶液，按“1.3.3.1”色譜條件進樣測定，通過測定峰面積，計算 RSD 值。

1.3.4.5 加樣回收率試驗。精密稱取已知檸檬烯含量的枳殼揮發油包合物6份，分別精密加入2 ml的濃度為1.489 6 mg/ml的對照品溶液，加入甲醇 18 ml，按“1.3.3.4”制備供試品溶液，按“1.3.3.1”色譜條件測定其含量，計算平均加樣回收率和RSD值。

1.3.5 正交試驗。通過查閱文獻，揮發油包合的常用方法有飽合水溶液法［6］、研磨法［7］、超聲法［8］3 種，試驗采用研磨法考察包合工藝。選擇β-CD用量、油:乙醇、研磨時間、烘干溫度4個因素為影響枳殼揮發油研磨法包合的主要因素，每個因素設定3個水平，進行L9(34)正交試驗(表1)。

表1 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 枳殼揮發油的提取 按“1.3.1”方法操作，得到的枳殼揮發油為淡黃色，香氣濃郁，提取率約為2.0%。

2.2 檢測波長的確定 由圖1可知，檸檬烯在210 nm波長處有最大吸收，故選擇210 nm作為檢測波長。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察。由圖2可見，檸檬烯對照品的線性回歸方程為 Y=151.45X-14.125(R2=0.999 9)，表明當檸檬烯進樣體積在2～18 μl范圍內峰面積與進樣量呈線性關系，即濃度在0.029 8～0.268 2 mg/ml范圍內峰面積與質量濃度線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗。按照“1.3.4.2”操作，經過計算得峰面積RSD值為0.99%，表明試驗精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗。按照“1.3.4.3”操作，通過計算得供試品溶液檸檬烯峰在25 h內峰面積RSD值為1.11%，表明供試品溶液在25 h內時穩定的。

2.3.4 重現性試驗。按照“1.3.4.4”操作，通過計算得檸檬烯峰面積RSD為0.76%，表明該供試品處理過程和分析方法均具有很好的重現性。

2.3.5 加樣回收率。從表2可以看出，平均加樣回收率為100.423 5%，RSD 值為1.37%，表明該方法準確、可靠，可用于枳殼揮發油β-環糊精包合物的含量測定。

表2 加樣回收率試驗結果

2.4 正交試驗 由表3直觀分析結果顯示A2B1C2D3為最佳工藝，由方差分析(表4)得出各因素對包合率的影響程度為A＞D＞B＞C，其中β-糊精用量(A)對試驗結果有顯著性影響。結合各因素水平對試驗結果影響的效應曲線(圖3)，確定枳殼揮發油環糊精包合的最佳工藝為A3B1C2D3，即揮發油與環糊精的用量比為1∶10、揮發油與無水乙醇比例為1∶1、研磨時間為30 min、烘干溫度為60℃。

2.5 包合工藝的驗證性試驗 由于確定的最佳提取方案，在正交設計表中未出現，需進行工藝驗證性試驗。按最佳包合工藝，取揮發油2份，進行工藝驗證，工藝驗證結果(表5)經計算RSD值為0.15%，證明此包合方法結果穩定可靠，可用于制備枳殼揮發油包合物，其高效液相譜圖如圖4所示。

表3 包合工藝正交試驗表與試驗結果

表4 方差分析結果

表5 工藝驗證結果

3 結論與討論

試驗結果表明，枳殼揮發油最佳包合工藝為10倍量β-環糊精，揮發油與無水乙醇1∶1混勻，研磨30 min，60℃烘干。該試驗建立了高相液相色譜法測定枳殼揮發油β-環糊精包合物中檸檬烯含量的方法，從而計算包合率的方法，并對該方法進行了方法學驗證。證明此方法簡單快速，且精密度高、回收率好，所得結果準確可靠，可用于枳殼揮發油β-環糊精包合物中檸檬烯含量的測定。而且經過穩定性試驗證明，揮發油在25 h內穩定，再次證明了枳殼揮發油采用高效液相色譜法測定的可行性。因此，該方法可以代替水蒸氣再蒸餾枳殼揮發油β-環糊精包合物計算包合率的方法，為揮發油環糊精包合率測定提供更為準確，可靠的檢測方法。

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