延邊黃牛血液Exosome的提取和鑒定

李金輝，蔡錦順，于龍政，婁安鋼，樸明淑，關立增*(.延邊檀君藥業有限公司，吉林延吉3300;.延邊大學農學院，吉林延吉3300)

延邊黃牛是我國著名五大地方良種牛之一，也是我國寶貴的畜禽品種財富［1］。延邊黃牛養殖業已成為延邊朝鮮族自治州農村經濟中的支柱產業，是農民增收致富的主要途徑。延邊黃牛也具有生產高檔牛肉的品質特性，延邊黃牛肉質細膩多汁，鮮美可口，其風味可與韓牛等媲美，其肉質明顯優于其他品種牛，特別是不飽和脂肪酸含量明顯高于其他品種牛，因此延邊黃牛養殖業蘊含著廣闊的市場前景和巨大的財富潛力［2］。但是，延邊黃牛飼養中也存在生長周期長、出欄率低等弊端，其中延邊黃牛的生長效率是影響延邊黃牛養殖業發展的關鍵因素之一［3-4］。因此，如何提高延邊黃牛的生長效率是加快延邊黃牛產業快速發展的關鍵問題之一。

外胞體(Exosome)是由多種細胞分泌的一種含有多種成分的納米級小囊泡并存在于不同的細胞和體液當中［5-6］。Exosome的組成成分復雜，含有多種活性成分，如蛋白質、mRNA、miRNA和脂類等［7］。細胞或組織不同，形成的Exosome具有不同的功能。Exosome主要包括參與細胞間通訊交流、免疫調節、信號傳遞、生長發育和分化等過程［8］。筆者從延邊黃牛分離并鑒定了Exosome，旨在為進一步研究Exosome對延邊黃牛生長軸調控的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 Sigma6k-15超速冷凍離心機(美國 Sigma公司)、超高速冷凍離心機(美國Kemdro公司)、JEM-1230EX透射電鏡(日本)、100 ku MWCO CentripIus離心超濾管(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體樣小體的分離。取延邊黃牛全血置于50 ml離心管中，2 500 r/min離心5 min，取上清獲得血漿。取血漿于另一個50 ml離心管中，4 000 r/min離心10 min。離心后取上清于另1個50 ml離心管中，12 000 r/min離心40 min。離心后取上清置于超速離心管中，放入超速離心機中，50 000 r/m離心1 h。離心后，棄上清，用0.01 mol/L PBS將沉淀吹下，吸入EP管中，使用移液器反復吹打，使其溶解。再次將溶液于超速離心管中，放入超速離心機中，50 000 r/min離心1 h。離心后棄上清，吸入小離中，加入0.01 mol/L PBS溶液，使用移液器將沉淀反復吹打，使其完全混勻即為Exosomes溶液。于4℃下短期保存，-20℃下長期保存。

1.2.2 Exosome 的形態觀察。取 25 μl Exosome 溶液滴于載樣銅網上，室溫靜置1 min。用干凈濾紙從側面吸干液體，滴加30 μl 3%磷鎢酸溶液(pH 6.8)于銅網上，室溫環境下負染3 min。用濾紙吸干負染液，白熾燈下烤干約l0 min，置于透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Exosome的蛋白定量。采用Lorry法進行蛋白質定量［9］。

2 結果與分析

2.1 Exosome的電鏡觀察 獲得的延邊黃牛血漿經過一系列離心和超離心后得到Exosome，所得Exosome經負染在透射電鏡下觀察其形態為圓形或橢圓形雙層膜小囊泡，且中間的密度要低于邊緣，在邊緣處有脂質雙層膜結構，整個Exosome的直徑為30～100 nm，膜結構完整(圖1)。

2.2 Exosome的蛋白定量 延邊黃牛血液中的Exosome內的蛋白濃度約為2 mg/ml，說明Exosome中存在著大量的蛋白質。

3 結論與討論

延邊黃牛的生長效率是影響延邊黃牛養殖業發展的關鍵因素之一。因此，如何提高延邊黃牛的生長效率是人們關注的主要焦點。外胞體(Exosome)是由多種細胞分泌的一種含有多種成分的納米級小囊泡并存在于不同的細胞和體液中。Exosome的組成成分復雜，含有多種活性成分，如蛋白質、mRNA、miRNA和脂類等，可能參與細胞間通訊交流、免疫調節、信號傳遞、生長發育和分化等過程［7-8］。細胞分泌的Exosome可以分泌到體液(如血漿)中，因此從血漿中可以獲得Exosomes［5-6］。然而，延邊黃牛血液中的Exosome的結構特點及其對延邊黃牛生長發育的影響的研究尚未見報道。筆者利用超速離心法從延邊黃牛血液中分離到Exosome，并進行了電鏡觀察和蛋白定量，為進一步研究Exosome對延邊黃牛生長影響的研究奠定了基礎。

目前，Exosome的提取方法主要有超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾和試劑盒等方法［10］。該試驗中主要采用超速離心分離Exosome，雖然該方法有耗時耗力、處理的樣品數少等缺點，但采用該方法能制備出干凈的Exosome，因此該試驗中采用超速離心分離Exosome。

目前，鑒定Exosome主要采用電鏡和Western blotting等方法。電鏡法直觀可靠，既可以觀察到Exosome的結構，也可以測量其大小，是鑒定Exosome的首選方法［11］。筆者通過電鏡技術對延邊黃牛血液來源的Exosom進行超微形態學觀察，從電鏡負染觀察可以看出，與其他來源的Exosome均為圓形或橢圓形雙層膜小囊泡，這與其他文獻內描述的外胞體形態一致［12］。通過蛋白定量結果表明，Exosome中存在一定濃度的蛋白質。

電鏡和蛋白定量結果表明，使用超速離心方法能成功從延邊黃牛血液中分離到Exosome，從而為進一步研究Exosome對延邊黃牛生長軸調控的分子機制提供理論和工作基礎。

［1］王旭有.延邊黃牛生產有機肉牛的資源優勢［J］.當代生態農業，2010(3/4):93-94.

［2］王旭有.五個角度構建延邊黃牛品牌競爭力［J］.探討與研究，2012(12):28-29.

［3］王志剛，劉和，楊胤軒.“延邊黃牛”地理標志的歷史沿革、發展現狀、存在問題及前景展望［J］.農業經濟與管理，2014(3):67-71.

［4］房瑞景.延邊黃牛產業化發展中的問題與政策建議［J］.農村經濟與科技，2009，20(10):51-52.

［5］張堯，吳小候.Exosome的生物學特性及其在免疫調節中的作用［J］.重慶醫學，2008，37(18):2111-2113.

［6］SCHOREY J S，BHATNAGAR S.Exosome function:from tumor immunology to pathogen biology［J］.Traffic，2008，9(6):871.

［7］MATHIVANAN S，SIMPSON R J.ExoCarta:a compendium of exosomalproteins and RNA［J］.Proteomics，2009(9):4997-5000.

［8］VLASSOV A V，MAGDALENO，SETTERQUIST R，et al.Current knowledge of their compoition，biological，and diagnotic and therapeutic potential［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1820(7):940-948.

［9］劉維全.動物生物化學實驗指導［M］.北京:中國農業出版社，2008:82.

［10］盧婉，楊人強，王伶.外泌體的研究進展［J］.生命的化學，2013，33(4):438-442.

［11］李艷艷，張淵，代義，等.人尿液中exosomes的分離及鑒定［J］.中國生物制品學雜志，2011，24(2):230-236.

［12］L?SSER CECILIA，ALIKHANI VESTA SEYED，EKSTR?M KARIN，et al.Human saliva，plasma and breast milk exosomes contain RNA:uptake by macrophages［J］.Journal of Translational Medicine，2011，9(1):9.