延邊黃牛血液Exosome的提取和鑒定

李金輝，蔡錦順，于龍政，婁安鋼，樸明淑，關(guān)立增*(.延邊檀君藥業(yè)有限公司，吉林延吉3300;.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉3300)

延邊黃牛是我國(guó)著名五大地方良種牛之一，也是我國(guó)寶貴的畜禽品種財(cái)富［1］。延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)已成為延邊朝鮮族自治州農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中的支柱產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)民增收致富的主要途徑。延邊黃牛也具有生產(chǎn)高檔牛肉的品質(zhì)特性，延邊黃牛肉質(zhì)細(xì)膩多汁，鮮美可口，其風(fēng)味可與韓牛等媲美，其肉質(zhì)明顯優(yōu)于其他品種牛，特別是不飽和脂肪酸含量明顯高于其他品種牛，因此延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)蘊(yùn)含著廣闊的市場(chǎng)前景和巨大的財(cái)富潛力［2］。但是，延邊黃牛飼養(yǎng)中也存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、出欄率低等弊端，其中延邊黃牛的生長(zhǎng)效率是影響延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一［3-4］。因此，如何提高延邊黃牛的生長(zhǎng)效率是加快延邊黃牛產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。

外胞體(Exosome)是由多種細(xì)胞分泌的一種含有多種成分的納米級(jí)小囊泡并存在于不同的細(xì)胞和體液當(dāng)中［5-6］。Exosome的組成成分復(fù)雜，含有多種活性成分，如蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂類等［7］。細(xì)胞或組織不同，形成的Exosome具有不同的功能。Exosome主要包括參與細(xì)胞間通訊交流、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞、生長(zhǎng)發(fā)育和分化等過程［8］。筆者從延邊黃牛分離并鑒定了Exosome，旨在為進(jìn)一步研究Exosome對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)軸調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Sigma6k-15超速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Sigma公司)、超高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Kemdro公司)、JEM-1230EX透射電鏡(日本)、100 ku MWCO CentripIus離心超濾管(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體樣小體的分離。取延邊黃牛全血置于50 ml離心管中，2 500 r/min離心5 min，取上清獲得血漿。取血漿于另一個(gè)50 ml離心管中，4 000 r/min離心10 min。離心后取上清于另1個(gè)50 ml離心管中，12 000 r/min離心40 min。離心后取上清置于超速離心管中，放入超速離心機(jī)中，50 000 r/m離心1 h。離心后，棄上清，用0.01 mol/L PBS將沉淀吹下，吸入EP管中，使用移液器反復(fù)吹打，使其溶解。再次將溶液于超速離心管中，放入超速離心機(jī)中，50 000 r/min離心1 h。離心后棄上清，吸入小離中，加入0.01 mol/L PBS溶液，使用移液器將沉淀反復(fù)吹打，使其完全混勻即為Exosomes溶液。于4℃下短期保存，-20℃下長(zhǎng)期保存。

1.2.2 Exosome 的形態(tài)觀察。取 25 μl Exosome 溶液滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min。用干凈濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加30 μl 3%磷鎢酸溶液(pH 6.8)于銅網(wǎng)上，室溫環(huán)境下負(fù)染3 min。用濾紙吸干負(fù)染液，白熾燈下烤干約l0 min，置于透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Exosome的蛋白定量。采用Lorry法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 Exosome的電鏡觀察 獲得的延邊黃牛血漿經(jīng)過一系列離心和超離心后得到Exosome，所得Exosome經(jīng)負(fù)染在透射電鏡下觀察其形態(tài)為圓形或橢圓形雙層膜小囊泡，且中間的密度要低于邊緣，在邊緣處有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，整個(gè)Exosome的直徑為30～100 nm，膜結(jié)構(gòu)完整(圖1)。

2.2 Exosome的蛋白定量 延邊黃牛血液中的Exosome內(nèi)的蛋白濃度約為2 mg/ml，說明Exosome中存在著大量的蛋白質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

延邊黃牛的生長(zhǎng)效率是影響延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。因此，如何提高延邊黃牛的生長(zhǎng)效率是人們關(guān)注的主要焦點(diǎn)。外胞體(Exosome)是由多種細(xì)胞分泌的一種含有多種成分的納米級(jí)小囊泡并存在于不同的細(xì)胞和體液中。Exosome的組成成分復(fù)雜，含有多種活性成分，如蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂類等，可能參與細(xì)胞間通訊交流、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞、生長(zhǎng)發(fā)育和分化等過程［7-8］。細(xì)胞分泌的Exosome可以分泌到體液(如血漿)中，因此從血漿中可以獲得Exosomes［5-6］。然而，延邊黃牛血液中的Exosome的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)發(fā)育的影響的研究尚未見報(bào)道。筆者利用超速離心法從延邊黃牛血液中分離到Exosome，并進(jìn)行了電鏡觀察和蛋白定量，為進(jìn)一步研究Exosome對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)影響的研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，Exosome的提取方法主要有超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾和試劑盒等方法［10］。該試驗(yàn)中主要采用超速離心分離Exosome，雖然該方法有耗時(shí)耗力、處理的樣品數(shù)少等缺點(diǎn)，但采用該方法能制備出干凈的Exosome，因此該試驗(yàn)中采用超速離心分離Exosome。

目前，鑒定Exosome主要采用電鏡和Western blotting等方法。電鏡法直觀可靠，既可以觀察到Exosome的結(jié)構(gòu)，也可以測(cè)量其大小，是鑒定Exosome的首選方法［11］。筆者通過電鏡技術(shù)對(duì)延邊黃牛血液來源的Exosom進(jìn)行超微形態(tài)學(xué)觀察，從電鏡負(fù)染觀察可以看出，與其他來源的Exosome均為圓形或橢圓形雙層膜小囊泡，這與其他文獻(xiàn)內(nèi)描述的外胞體形態(tài)一致［12］。通過蛋白定量結(jié)果表明，Exosome中存在一定濃度的蛋白質(zhì)。

電鏡和蛋白定量結(jié)果表明，使用超速離心方法能成功從延邊黃牛血液中分離到Exosome，從而為進(jìn)一步研究Exosome對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)軸調(diào)控的分子機(jī)制提供理論和工作基礎(chǔ)。

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