影響酶法回收南極磷蝦殼中蛋白質及蝦青素的因素研究

于沛沛，吳文嫻，劉富俊，姜啟興，王藝穎，張慶香，曹 雪，夏文水*

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2.遼寧省大連海洋漁業集團公司，遼寧大連116113)

南極磷蝦生活在南大洋，是人類可以利用的最大蛋白質資源，具有很高的開發價值。在蝦體被開發利用的同時，產生大量的蝦殼廢棄物(約40% ～50%的加工廢棄物產生)。傳統的處理方法是將蝦殼制成蝦粉作為動物飼料，這種方法所產生的經濟效益比較低，并不能達到綜合利用的效果［1－3］。筆者利用堿性蛋白酶水解南極磷蝦加工下腳料中的蛋白質，從而增加蝦青素的溶出，同時研究在堿性蛋白酶作用下不同加熱溫度、酶底比、加熱時間、pH對蛋白質和蝦青素回收的影響，其目的在于在提取蛋白質的同時又能將蝦青素回收，使回收的蛋白質中含有較高含量的蝦青素，增強蛋白質的應用價值［4－6］。

1 材料與方法

1.1 材料 南極磷蝦(Euphausia superb)，由遼寧省大連海洋漁業集團提供，于低溫(－18℃)冷庫中貯藏備用;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)，購自Novozymes公司;4K-15高速冷凍離心機，Sigma公司;UV1000紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司;YCR-180采肉機，上海華夏漁業機械儀器工貿公司;DS-1高速組織搗碎機，上海標本模型制造廠。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質回收率的測定。工藝流程:南極磷蝦殼→按比例加水攪勻→調pH→Alcalase堿性蛋白酶酶解→沸水浴滅酶15 min→4 000 r/min離心l5 min→上清液過濾去油→酶解液→測定氮含量［6］。

蛋白質含量測定:采用微量凱氏定氮進行測定，按GB5009.5.85 測定。

1.2.2 蝦青素含量的測定。工藝流程:南極磷蝦殼→按比例加水攪勻→調pH→Alcalase堿性蛋白酶酶解→沸水浴滅酶15 min→4 000 r/min離心15 min→取沉淀→丙酮抽提→472 nm 下測其吸光度［6］。

式中，A為472 nm處吸光度;V為丙酮消耗的體積(ml);N為總稀釋倍數;E為蝦青素在丙酮中的消光系數，E=2 200;W為沉淀質量(g)。

1.2.3 在堿性蛋白酶的作用下各種因素對蛋白質回收率的影響。稱取30 g南極磷蝦殼，按照5∶1的水料比加水混合，考察加熱時間(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h)，加熱溫度(40、45、50、55、60 ℃)，pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，酶底比(1 250、2 500、3 750、5 000、6 250 U/g)對蛋白質回收率的影響［6］。

1.2.4 在堿性蛋白酶的作用下各種因素對蝦青素含量的影響。稱取30 g南極磷蝦殼，按照5∶1的水料比加水混合，考察加熱時間(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h)，加熱溫度(40、45、50、55、60 ℃)，pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，酶底比(1 250、2 500、3 750、5 000、6 250 U/g)對蝦青素含量的影響［6］。

2 結果與分析

2.1 酶解溫度對蛋白質回收率和蝦青素含量的影響 由圖1可以看出，隨著溫度的升高，蝦青素及蛋白質回收率均是先增加后下降，40～50℃的范圍內，隨著溫度的上升，蛋白質的回收率不斷提高，當溫度超過50℃時，蛋白質的回收率呈下降趨勢;溫度在40～50℃時，蝦青素的得率隨溫度的升高緩慢上升，當溫度介于50～55℃時，隨著溫度的上升，蝦青素的得率急劇增加，溫度超過55℃時，蝦青素的得率迅速下降。這主要是因為開始時隨溫度的升高蛋白質溶出增加，這時與磷蝦蛋白結合的蝦青素雖然逐漸斷開，但蛋白質的溶出占主導。隨著蛋白質溶出增多，越來越多的蝦青素與蛋白質斷開，游離蝦青素增多，從而50～55℃時，蝦青素得率急劇增加，而隨著溫度繼續升高，酶活受到抑制，蛋白質回收率下降，對蝦青素而言，在高溫下又極易降解，因此，溫度超過55℃時其回收率下降更加迅速。由試驗可知，Alcalase堿性蛋白酶酶解南極磷蝦蝦殼時，要獲得較高的蛋白質回收率，此反應溫度以50℃為宜，而要獲得較多蝦青素，則以55℃為宜。

2.2 酶解時間對蛋白質回收率和蝦青素含量的影響 從圖2可以看出，蛋白質的回收率在0.5～2.0 h范圍內，隨著時間的延長顯著增加;在2.0～4.0 h范圍內，蛋白質的回收率上升得十分緩慢。蝦青素得率在0.5～1.0 h范圍內，隨著時間的延長顯著增加，在1.0～2.0 h的范圍內，逐漸趨于平緩，2.0 h以后，隨著時間的延長而降低。這是由于隨著時間延長，蛋白質水解率提高，蝦青素與蛋白質的結合逐漸變得松散，蝦青素更容易被提取出來，所以開始時蝦青素得率逐漸提高;隨著蛋白質水解度的提高，蝦青素與蛋白質的結合進一步變得松散，甚至有蝦青素游離出來，另外，隨著時間的延長蝦青素也會逐漸氧化損失，因此，當酶解反應時間太長，沉淀中蝦青素回收率會急劇下降。該試驗最終確定，要獲得較高的蛋白質和蝦青素回收率，反應時間以2.0 h為宜［8］。

2.3 pH對蛋白質回收率和蝦青素含量的影響 從圖3可以看出，pH會影響酶促反應速度及酶的活性，當水解pH在7.0～8.5范圍內時，隨著pH的上升，蛋白質的回收率和蝦青素的含量不斷上升，當pH＞8.5時，隨著pH的上升，二者趨于平緩，有不發生變化的趨勢。Alcalase堿性蛋白酶的最適pH范圍為8.0～8.5，因而，要獲得較高的蛋白質回收率和蝦青素得率，pH在8.5比較適宜。

2.4 酶底比對蛋白質回收率和蝦青素含量的影響 從圖4可以看出，酶底比在1 250～3 750 U/g范圍內，隨著酶用量的增加，蛋白質的回收率顯著增大，當酶底比在3 750～6 250 U/g范圍內時，隨酶底比增加，蛋白質的回收率雖然呈上升趨勢，卻十分緩慢并逐漸趨于平緩，如前述由于蝦青素是與蛋白質結合在一起的，因此蝦青素的回收與蛋白質表現類似的趨勢。酶作為一種催化劑，可以提高反應速率，但并不是酶底比越大，反應時間就越短，因此該試驗最終確定回收蛋白質和蝦青素的酶底比為3 750 U/g［9］。

3 結論

該試驗研究了酶解溫度、時間、pH、酶底比等因素對酶法回收南極磷蝦蛋白質及蝦青素的影響。結果得出，選擇Alcalase堿性蛋白酶為提取劑，酶解時間2 h，酶底比3 750 U/g，pH 8.5，酶解溫度為50℃時，蛋白質的提取率最高;酶解時間為2 h，酶底比3 750 U/g，pH 8.5，酶解溫度為55 ℃時，蝦青素的提取率最高。

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