千層金葉片化學(xué)成分初步研究

余雪芳，曹莉莉，李永裕，吳少華*(.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州35000;.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物天然產(chǎn)物研究所，福建福州35000)

千層金(Melaleuca bracteata)屬桃金娘科白千層屬，又名黃金香柳、黃金寶樹，為常綠小喬木或灌木。千層金生長快，適生范圍廣，分枝性強，耐修剪，且株型直立，枝條柔軟細長，葉片全年呈金黃色或鵝黃色。作為一種不可多得的色葉樹種，千層金在園林上的應(yīng)用越來越廣泛。千層金葉片富含植物精油，芳香宜人，具有很強的殺蟲和殺螨效果［1］。此外，千層金還具有重要的藥用保健價值。在南非，當(dāng)?shù)厝擞们咏鹁徑忸^疼，還用其作為烹飪時包裹食物的材料，或加工成床席［2－4］。

目前，關(guān)于千層金的研究主要集中在栽培技術(shù)、組織培養(yǎng)方面，而對其化學(xué)活性成分方面的研究只有少量報道，且多集中在精油方面。千層金葉片中所含有的化學(xué)成分比較復(fù)雜，種類繁多，至今還未見有關(guān)千層金葉片化學(xué)成分系統(tǒng)研究的報道。該研究對千層金葉片中各類化學(xué)成分進行定性分析，初步確定千層金葉片中可能含有的化學(xué)成分種類，并對其總多酚、總黃酮以及總多糖活性成分進行了定量分析，旨在為千層金的進一步研究和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品。千層金葉片取自福建農(nóng)林大學(xué)，選取無機械損傷、無病蟲害千層金枝條，洗凈晾干后，將葉片采下，凍干，粉碎，過40目篩，于－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑。乙醇、乙酸乙酯、石油醚(沸程60～90℃)、鹽酸、氫氧化鈉、茚三酮、硫酸銅、α-萘酚、三氯化鐵、鐵氰化鉀、香草醛、溴酚藍、濃氨水、氯仿、濃硫酸、醋酸鎂、硼酸、硅鎢酸、氫氧化鉀、鹽酸羥胺、3，5－二硝基苯甲酸、苦味酸、亞硝酸鐵氰化鈉、磷鉬酸、香草醛等均為分析純。沒食子酸標準品、蘆丁標準品、葡萄糖標準品(Solarbio，純度≥98%)。

1.1.3 儀器。FW177中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、LGJ-25C冷凍干燥機(北京四環(huán)科技儀器廠有限公司)、BAS224S電子分析天平(Sartorius公司，德國)、DTY-5A超級智能恒溫循環(huán)器(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)、N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA公司，日本)、U-2900紫外/可見分光光度計(Hitachi公司，日本)、5810R離心機(Eppendorf公司，德國)，MB3basic振蕩器(IKA公司，德國)，HYG-B搖床(蘇州培英試驗設(shè)備有限公司)、SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)等。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品供試液制備。

1.2.1.1 水供試液。稱取千層金葉片粉末30 g于錐形瓶中，加入300 ml蒸餾水，于搖床振蕩(30℃，180 r/min)提取24 h后，再超聲提取2 h(300 W)。水提取液經(jīng)離心、減壓抽濾除去濾渣后，得到水供試液，檢測氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、苷類、鞣質(zhì)、有機酸、皂苷等物質(zhì)。

1.2.1.2 乙醇提取液。

(1)乙醇供試液。稱取千層金葉片粉末30 g于錐形瓶中，加入300 ml 95%乙醇，于搖床振蕩(30℃，180 r/min)提取24 h后，再超聲提取2 h(300 W)，離心過濾，即得乙醇供試液，檢測黃酮、蒽醌、酚類、鞣質(zhì)等物質(zhì)。

(2)酸水供試液。取2/3乙醇供試液，減壓濃縮至無醇味，加入30 ml 5%鹽酸，充分攪拌后過濾，所得濾液即為酸水供試液，檢測生物堿。

(3)乙酸乙酯供試液。將(2)中酸水解不溶的部分用30 ml乙酸乙酯溶解，然后用30 ml 5%NaOH溶液振搖洗滌2次，棄去堿水層。乙酸乙酯層繼續(xù)用蒸餾水洗至中性，棄去水洗層，將剩余液體減壓旋蒸除去乙酸乙酯后，用15 ml 95%乙醇進行溶解，得到乙酸乙酯供試液，檢測香豆素、內(nèi)酯、強心苷等物質(zhì)。

1.2.1.3 石油醚供試液。稱取千層金葉片粉末30 g于錐形瓶中，加入300 ml石油醚(60～90℃)，于搖床振蕩(30℃，180 r/min)提取24 h后，再超聲提取2 h(300 W)，離心過濾，減壓濃縮至30 ml，即得石油醚供試液，檢測揮發(fā)油、油脂類物質(zhì)。

1.2.2 化學(xué)成分預(yù)試驗。采用試管法和紙色譜法，根據(jù)各供試液可能含有的化學(xué)成分類型，選擇經(jīng)典的特異顯色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)等，對千層金葉片中的化學(xué)成分進行定性分析。

1.2.3 總多酚、總黃酮和總多糖含量測定。

1.2.3.1 總多酚含量測定。標準曲線繪制:采用Folin-Ciocaheu法［5］。精密稱取干燥至恒重的沒食子酸5.0 mg，用水溶解定容至100 ml，即為沒食子酸標準溶液。分別精確吸取沒食子酸標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 ml于棕色容量瓶中，加蒸餾水至11 ml，并以蒸餾水為對照。然后，分別依次加入Folin-Ciocaheu試劑1 ml、75 g/L Na2CO3溶液8 ml，搖勻，在室溫下避光靜置1 h，于760 nm處測定吸光值。以吸光值為縱坐標、相應(yīng)沒食子酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為 y=94.030 0x+0.010 0，R2=0.996。

樣品總多酚含量的測定:稱取千層金葉片粉末4.00 g于錐形瓶中，加入40 ml 50%乙醇水溶液，超聲(300 W)提取15 min，離心，取上清液稀釋100倍后吸取1 ml，按標準曲線方法測定吸光值。將吸光值代入標準曲線方程計算樣品中總多酚含量，結(jié)果以等量的沒食子酸表示，即mg GA/g(GA，gallic acid，沒食子酸)。

1.2.3.2 總黃酮含量測定。標準曲線繪制:采用Al(NO3)3-NaNO2比色法［6］。精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10.0 mg，用60%乙醇溶解定容至50 ml，即得0.2 mg/ml蘆丁標準溶液。分別精確吸取蘆丁標準溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml于25 ml容量瓶中，加60%乙醇溶液至10 ml，并以60%乙醇為對照。然后，加入1 ml 5%NaNO2溶液，搖勻靜置6 min后，加入1 ml 10%Al(NO3)3溶液，搖勻靜置6 min，再加入1 ml 4%NaOH溶液，最后用60%乙醇定容至25 ml，搖勻后放置15 min，在500 nm波長處測定吸光值。以吸光值為縱坐標、相應(yīng)蘆丁濃度為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為 y=6.032 7x－0.001 3，R2=0.999。

樣品總黃酮含量的測定:稱取千層金葉片粉末4.00 g于錐形瓶中，加入40 ml 50%乙醇水溶液，超聲(300 W)提取15 min，離心，取上清液1 ml，按標準曲線項下方法進行測定。將吸光值代入標準曲線方程計算樣品中總黃酮含量，結(jié)果以等量的蘆丁表示，即mg RT/g(RT，rutin，蘆丁)。

1.2.3.3 總多糖含量測定。標準曲線繪制:采用苯酚－硫酸比色法［7］。精密稱取葡萄糖標準品2.5 mg，用蒸餾水溶解定容至25 ml，即得0.1 mg/ml葡萄糖標準液。精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml標準液于容量瓶中，分別加水至1 ml，再加入1 ml 5%苯酚，搖勻后加入5 ml濃硫酸，振蕩混勻，靜置5 min。經(jīng)沸水浴15 min后，迅速在冰水浴中冷卻至室溫，并放置30 min，于490 nm處測定吸光值。以吸光值為縱坐標、相應(yīng)葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為 y=42.564 0x+0.009 7，R2=0.999。

樣品總多糖含量測定:稱取千層金葉片粉末1.00 g于錐形瓶中，加入20 ml蒸餾水，100℃水浴浸提2.5 h，離心，取上清液2 ml，加入10 ml 95%乙醇醇沉30 min，再離心棄去上清液，用5 ml蒸餾水將沉淀溶解，取200 μl按標準曲線項下方法進行測定。將吸光值代入標準曲線方程計算樣品中總多糖含量，結(jié)果以等量的葡萄糖表示，即mg GC/g(GC，glucose，葡萄糖)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分檢測結(jié)果 水供試液、乙醇提取液和石油醚供試液化學(xué)成分檢測試驗結(jié)果分別見表1～3。由表1～3所顯示的結(jié)果可以初步判定千層金葉片中可能含有氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、苷類、酚類、鞣質(zhì)、間二苯酚、間苯三酚化合物、有機酸、黃酮類、香豆素、內(nèi)酯類、強心苷、揮發(fā)油、油脂類、萜類、甾醇類等物質(zhì)，并證明不含皂苷、生物堿、蒽醌類物質(zhì)。

表1 水供試液檢測結(jié)果

2.2 總多酚、總黃酮和總多糖含量測定結(jié)果 試驗結(jié)果表明，千層金葉片干樣中總多酚含量為43.56±0.76 mg GA/g，總黃酮含量為11.34±0.20 mg RT/g，總多糖的含量為16.13 ±0.32 mg GC/g。

表3 石油醚供試液檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

(1)已有的報道表明，千層金葉片中含有揮發(fā)油［8］、氨基酸［9］、酯類［4］和萜類［10］化合物。Naidu［9］從千層金中提取得到了反式-4-羥基-N-甲基脯氨酸;Tshibangu等［4］從千層金葉片中分離得到2種酯類化合物樺木酸酯和熊果酸乙酸酯;Adesanwo等［10］從千層金中分離得到2種三萜類化合物，并鑒定為白樺脂酸和齊墩果酸。該試驗利用植物中有機成分與專屬試劑發(fā)生顯色或沉淀反應(yīng)的原理，采用試管法和濾紙片法，檢測到千層金葉片中含有揮發(fā)油、氨基酸、酯類、三萜類化合物、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、苷類、酚類、鞣質(zhì)、間二苯酚、間苯三酚化合物、有機酸、黃酮類、香豆素、內(nèi)酯類、強心苷、油脂類、甾醇類等物質(zhì)。化學(xué)預(yù)試法雖簡便易行，但各類定性試驗均有例外，且植物葉片所含成分復(fù)雜，存在相互干擾的問題，故此法只能提供初步線索。此外，有些含量低的成分，通過預(yù)試驗方法也很難測定出，因此僅憑化學(xué)預(yù)試法來判定某種成分是否存在是不全面的，還需結(jié)合文獻報道或利用化合物標準品進行對照試驗或采用高效液相色譜或高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等進行進一步確定。

(2)試驗對千層金葉片中的總多酚、總黃酮和總多糖進行了進一步定量分析，結(jié)果可知千層金葉片凍干樣中總多酚、總黃酮、總多糖的含量分別為 43.56±0.76 mg GA/g、11.34 ±0.20 mg RT/g、16.13 ±0.32 mg GC/g。肖越［11］采用超聲輔助提取互葉白千層多糖，并從互葉白千層多糖中分離、純化得到單一多糖MAP-2，研究結(jié)果表明MAP-2具有較強抗氧化能力。除抗氧化活性外，多糖還具有免疫［12］、降血脂［13］、抑菌［14］、抗腫瘤［15］等生物活性。此外，千層金葉片中還含有較多的多酚類和黃酮類化合物。多酚和黃酮作為天然產(chǎn)物中兩大重要活性成分，具有重要的研究意義:多酚具有抗腫瘤、抗氧化［16］、抑菌［17］等活性;黃酮也具有抗氧化［18］、抑菌［19］、消炎［20］等生物活性。可對千層金葉片多酚、黃酮和多糖進行進一步的研究，包括提取工藝、生物活性、化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)等。

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