酶輔助提取金銀花中綠原酸與多糖的工藝研究

石奇

(西安文理學院化學與化學工程學院，陜西 西安 710065)

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花［1］。現代藥理研究表明，金銀花具有抑菌［2］、抗病毒［3］、抗氧化［4］、抗腫瘤［5］等藥理作用。金銀花綠原酸和金銀花多糖同為金銀花的主要活性成分，都具有抗細菌、抗氧化和抗腫瘤等功能［6-9］。植物中活性物質的提取方法有多種，如水提法、酶提法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法等。酶提法具有快速、高效、反應時間短、溫和等諸多優點，已應用于植物活性成分的提取上［10-11］。

由于綠原酸和多糖都具有很好的藥物活性，在食品、保健、醫藥和日用化工等多個領域具有重要的應用，而以往的研究一般只提取金銀花中的一種有效成分，目前還未見同時提取這兩種活性成分的工藝報道，本研究以酶提法為輔助，采用酶法水提醇沉一套工藝將金銀花中的綠原酸和多糖一并取出分離，以期同時獲得較高得率的綠原酸、多糖，為合理利用藥材資源及工業化生產提供實驗室理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

乙醇、丙酮、甲醇、磷酸、乙腈、乙酸乙酯、三氯乙酸、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸均為分析純;金銀花藥材，產自河北省邢臺市;綠原酸標準品(純度≥98%)，購自天津市一方科技有限公司;纖維素酶(酶活力≥400 U/mg)。

RE-52AA 型旋轉蒸發儀;LXJ-64-01 型離心機;755B 型分光光度計;YP202N 型電子天平;101 型電熱鼓風干燥箱;Nicolet 5700 型紅外光譜儀;AGILENTLC12 型高效液相色譜儀。

1.2 綠原酸與多糖提取

取100.00 g 金銀花干燥粉末，加入1∶10 的蒸餾水以及一定量的纖維素酶，一定溫度提取數次，合并多次提取液與金銀花殘渣，離心分離，液體減壓濃縮，1∶4(體積比)無水乙醇低溫沉淀，離心分離。醇沉固體低溫真空干燥，8%三氯乙酸脫蛋白，常溫攪拌25 min，離心分離，上清液乙醇沉淀，靜置，離心，固體用乙醇、丙酮依次進行洗滌，低溫真空干燥，得金銀花多糖。首次醇沉操作所得液體與金銀花料渣混合，回流提取2 h，離心分離，液體減壓濃縮，乙酸乙酯純化處理［12］，低溫真空干燥，得金銀花綠原酸。

1.3 綠原酸含量測定

采用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸［13］。色譜柱:C18粒(250 nm×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈∶0. 4% 磷酸(15 ∶85)，超聲振蕩15 min，流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，樣品在進樣前經0.45 μm 濾膜過濾。

精密稱取綠原酸對照品0.010 6 g，加50%甲醇溶解并稀釋至50.0 mL，即為對照品溶液。精密吸取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 置棕色量瓶中加50%甲醇稀釋至10.0 mL 搖勻，按上述色譜條件，以峰面積積分值為縱坐標，濃度為橫坐標，得綠原酸標準工作曲線y =20 763x +235.92，相關系數為R2=0.999 3，其線性范圍為:21.20 ～106.0 μg/mL。

1.4 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法［14］，測定金銀花提取物中總糖含量。以葡萄糖為標準樣品，分別取標準溶液(質量濃度為10 mg/mL)0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL 依次加水，為1 mL。另取蒸餾水1 mL作空白實驗，每支試管加10%苯酚溶液1 mL，搖勻。然后每支試管中緩慢加入H2SO45 mL，并放入冷水中冷卻，搖勻。在490 nm 下比色測定，以葡萄糖質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線得方程y=0.030 3x+1.800 1，R2=0.995 8。

2 結果與討論

2.1 提取溫度對綠原酸與多糖得率的影響

取酶用量為0.2%，提取時間為60 min，探討不同提取溫度對金銀花綠原酸與多糖得率的影響，實驗結果見圖1。

圖1 提取溫度對綠原酸和多糖得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on yield of chlorogenic acid and polysaccharide

由圖1 可知，提取溫度為50 ℃時，酶法輔助對綠原酸和多糖的提取效果最好，隨著提取溫度升高，對多糖提取的影響不大，但使得綠原酸的得率下降，可能是由于體系溫度升高導致酶活力下降對綠原酸提取的負面影響較大，而對多糖提取影響較小。

2.2 酶用量對綠原酸與多糖得率的影響

固定提取溫度為50 ℃，提取時間60 min，考察不同酶用量對兩種產品得率的影響，實驗結果見圖2。

圖2 酶用量對綠原酸和多糖得率的影響Fig.2 Effects of cellulase concentration on extraction yield of chlorogenic acid and polysaccharide

由圖2 可知，隨著酶用量的增加，提取綠原酸和多糖的得率呈上升趨勢，但當酶用量超過0.3% ～0.4%后，有效成分提取得率增效趨于平緩，這主要是由于纖維素酶的加入使得金銀花細胞壁破壞，增加了綠原酸和多糖的溶出，隨著酶用量的增加，金銀花中兩種有效成分大部分已溶出，所以繼續增加酶濃度將不再顯著增加提取效果。

2.3 提取時間對綠原酸與多糖得率的影響

設定提取溫度為50 ℃，酶用量為0.4%，比較不同提取時間對產品得率的影響，實驗結果見圖3。

圖3 提取時間對綠原酸和多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on yield of chlorogenic acid and polysaccharide

由圖3 可知，隨著提取時間的延長，金銀花多糖的提取得率呈先增大后下降的狀態，而金銀花綠原酸的提取得率呈先增大，到90 min 后再繼續延長提取時間對其提取得率的影響不大，這主要是提取時間較長后導致多糖分解，而綠原酸變化不大。

2.4 正交實驗優化

根據上述單因素實驗探索情況，結合提取溫度、酶用量與提取時間3 個因素，各取3 個水平，選用L9(34)的正交表，以綠原酸得率與多糖得率為考察指標，經權重得率(綠原酸、多糖得率權重值各為0.5)，對酶輔助提取工藝進行優化，并對結果進行極差分析，確定最優工藝，正交實驗結果見表1。

表1 正交實驗設計與結果Table 1 Results of orthogonal test

由表1 可知，3 個因素對提取效果的影響程度大小為:提取溫度﹥提取時間﹥酶用量，確定最佳的工藝條件為:提取溫度50 ℃，提取時間120 min，酶用量0.5%。在該最佳工藝條件下，重復3 次平行實驗，得金銀花綠原酸平均得率為4.90%，金銀花多糖平均得率為6.58%。

2.5 金銀花綠原酸HPLC 色譜檢測分析

將提取所得金銀花綠原酸樣品研成細粉，稱取細粉約0. 5 g，加入50% 甲醇50 mL，超聲處理15 min，放冷，過濾，吸取濾液5 mL，加50%甲醇至25 mL 即為提取樣品溶液。取綠原酸對照品(按1.3 節)與提取樣品溶液各20 μL 分別進樣測定，結果見圖4。

圖4 金銀花綠原酸HPLC 圖Fig.4 HPLC chromatogram of standard chlorogenic acid and chlorogenic acid from Flos Lonicerae

由圖4 可知，檢測物均在4.91 min 處出現最大吸收峰，可以斷定兩種物質為同一化合物。

2.6 金銀花多糖紅外光譜檢測分析

提取所得金銀花多糖的紅外分析見圖5。

圖5 金銀花多糖的紅外光譜圖Fig.5 IR spectra analysis of polysaccharides from Flos Lonicerae

由圖5 可知，提取所得多糖具有典型的多糖特征吸收峰［15］，3 402 cm－1處的吸收峰是—OH 的伸縮振動吸收峰，2 924 cm－1處是C—H 的伸縮振動吸收峰，波數1 620 cm－1處有 C O 非對稱的伸縮振動峰，1 404 cm－1處是C—H 變角振動，1 091 cm－1處為—OH 的變角振動吸收峰，在890 cm－1處存在β-型糖苷鍵的特征吸收峰，說明金銀花多糖為β-多糖。

3 結論

通過該實驗，可以在一條工藝下同時實現對金銀花綠原酸和金銀花多糖這兩種活性物質的提取，并得到較好的提取效果。金銀花多糖紅外分析表明該產物具有多糖的特征吸收峰，并初步斷定其結構為β-多糖型。經單因素實驗探索，由正交實驗得知提取溫度影響程度最大，其次是提取時間，酶用量影響最小，確定提取的最佳工藝參數為:提取溫度50 ℃，提取時間120 min，酶用量0.5%，得到金銀花綠原酸得率為4.90%，金銀花多糖得率為6.58%。

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