三代旁系血親婚育子代男性不育臨床及細(xì)胞分子遺傳學(xué)研究

劉項(xiàng)，季興哲，張洲，孫建華，周梁，王磊，宋娟，石絨，邢俊平

（1.陜西省婦幼保健院生殖中心男科，西安 710003；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 710061）

三代以內(nèi)旁系血親是指在血緣上和自己同出于三代以內(nèi)的親屬。三代旁系血親婚育是指堂兄弟姐妹或姨表、姑表兄弟姐妹之間的婚育。三代旁系血親之間的親緣系數(shù)為1／8，近婚系數(shù)為1／16，若近親結(jié)婚，他們的致病基因相遇的機(jī)會(huì)增多，后代智力低下、新生兒死亡率、先天性畸形和遺傳性疾病的發(fā)病率高，比非近親結(jié)婚遺傳病的發(fā)病率高3～150倍。然而，近親結(jié)婚對(duì)子代男性生育力的影響知曉甚少。本文對(duì)陜西省婦幼保健院生殖中心男科門診收治的3例三代旁系血親婚育子代的男性不育患者的臨床特點(diǎn)、細(xì)胞和分子遺傳學(xué)輔助檢查進(jìn)行報(bào)道，并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行討論。

一、資料與方法

1.臨床資料：病例1，男性，因“婚后8年未育”就診。體貌外觀、智力檢查、全身體格檢查及生殖器查體均無明顯異常，無明顯精索靜脈曲張，無外傷手術(shù)史、泌尿生殖系感染史及有害物質(zhì)接觸史。父母為姨表兄妹結(jié)婚，共兄弟姐妹4人。大姐適齡婚育后自然生育1子3女，二哥自然生育1子1女。外生殖器B 超檢查顯示：睪丸大小、形狀正常，無精索靜脈曲張。依據(jù)WHO 人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（第五版）標(biāo)準(zhǔn)行精液常規(guī)檢查：精液量3.6～4.0ml，pH 7.6～7.3，精子濃度39.70×106／ml～112.20×106／ml，精子活力0%～1%；精子形態(tài)檢查：正常形態(tài)率2%。

病例2，男性，系病例1的胞弟。病例1就診時(shí)詢問病史發(fā)現(xiàn)，其“婚后3年，未避孕未育”，行多次精液檢查示：精液量2.3～4.2ml，pH 7.1～7.5，精子濃度8.50×106／ml～10.30×106／ml，精子活力極低（2%～4%）；精子形態(tài)檢查：正常形態(tài)率1%。外生殖器B 超檢查顯示：睪丸大小、形狀正常，無精索靜脈曲張。

病例3，男性，因“婚后3年未育”就診。體貌外觀、智力檢查及全身體格檢查無異常。無外傷手術(shù)史、無泌尿生殖系感染史、無有害物質(zhì)接觸史。父母為姑表兄妹結(jié)婚，共姐弟2人，大姐適齡結(jié)婚后自然生育。外生殖器B 超檢查顯示：睪丸大小、形狀正常，無精索靜脈曲張。行多次精液常規(guī)檢查示：精液量及酸堿度正常，但梯度離心后均未見精子。行常規(guī)雙側(cè)睪丸活檢仍未見精子。

2.外周血標(biāo)本采集：嚴(yán)格按照無菌操作要求，分別采集3例患者外周靜脈血4～6 ml，包括兩份肝素抗凝標(biāo)本（全血內(nèi)含肝素100U／ml）及1份非抗凝標(biāo)本，分別用于核型分析、全血DNA 提取（-20℃保存?zhèn)溆茫┘把逍约に厮綔y(cè)定。

3.主要試劑及儀器：胎牛血清（杭州四季青），微量全血基因組DNA 提取試劑盒（Axygen biosciences，美國），雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒（羅氏，瑞士），Biomltra梯度聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（Sigma，美國），WD29403c 型紫外透視儀（北京六一儀器廠）。

4.實(shí)驗(yàn)研究：（1）血清睪酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）水平測(cè)定：嚴(yán)格按照羅氏診斷試劑盒說明書操作，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法分別測(cè)定血清T、FSH、LH 水平。正常參考值：T：9.71～30.53nmol／L，F(xiàn)SH：≤12.4 U／L，LH：≤8.6U／L。（2）細(xì)胞遺傳學(xué)研究：取經(jīng)肝素抗凝全血0.4～0.5ml，放置于5ml含小牛血清的培養(yǎng)液中混勻。恒溫37℃的孵育箱培養(yǎng)68～72h后，常規(guī)制備染色體標(biāo)本，進(jìn)行G 顯帶，油鏡下分析100個(gè)淋巴細(xì)胞。（3）Y 染色體AZF 微缺失檢測(cè)：①引物設(shè)計(jì)與合成：參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)［1-2］選擇合成15對(duì)基因和序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）片段的引物（表1）。ZFX／ZFY 作為內(nèi)參對(duì)照。引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。②外周血基因組DNA 提取：肝素抗凝外周血從-20℃取出放置室溫復(fù)融后，嚴(yán)格按照DNA 提取試劑盒說明書操作，提取外周血粒細(xì)胞基因組DNA。③目的基因片段的PCR擴(kuò)增：采用Biomltra梯度PCR 儀對(duì)所有外周血基因組DNA 模板進(jìn)行目的基因片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)。④目的基因片段的電泳檢測(cè)：經(jīng)PCR 擴(kuò)增的目的基因片段產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠的水平恒壓電泳，之后在紫外透視儀下觀察目的條帶并及時(shí)拍照存檔。

5.睪丸穿刺及活檢：行常規(guī)睪丸穿刺，穿刺針負(fù)壓抽取睪丸組織，活檢組織用Bouin液（北京海德）固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚0.5μm），HE 染色，使用日本Olympus BX51顯微鏡下觀察睪丸組織可見：生精小管水腫，腔內(nèi)生精細(xì)胞減少，未見明顯精子，睪丸組織病理學(xué)評(píng)分（Johnsen評(píng)分）7分。

二、結(jié)果

1.生育結(jié)局：病例1與病例2系胞弟，保守藥物治療后仍不能使妻子自然妊娠，因家庭經(jīng)濟(jì)原因，此2例患者不接受行輔助生殖助孕，至今未育。病例3常規(guī)睪丸穿刺活檢未見明顯精子，但考慮到Johnsen評(píng)分7 分，認(rèn)為其行睪丸顯微取精術(shù)的成功率較高，遂行睪丸顯微取精，獲得精子，與患者溝通后行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）助孕成功，現(xiàn)該患者妻子已妊娠近3月，常規(guī)產(chǎn)檢無異常。

2.血清性激素水平：3 例患者血清T、LH 和FSH 水平均正常（表2）。

3.染色體核型分析結(jié)果：外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行G 顯帶，分析100個(gè)淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示3例患者的染色體核型均為46，XY（圖1、圖2）。

4.Y 染色體AZF 微缺失情況：結(jié)果顯示3 例患者Y 染色體長臂區(qū)的AZFa、AZFb、AZFc、AZFd均無缺失（圖3）。

表1 PCR 引物序列

表2 患者血清性激素水平檢測(cè)結(jié)果

圖1 染色體核型分析原始圖像 ×1 000

圖2 染色體核型分析圖像 ×1 000

三、討論

圖3 Y 染色體AZF微缺失檢測(cè)（電泳圖）

三代旁系血親婚育是指堂兄弟姐妹或姨表、姑表兄弟姐妹之間的婚育，是近親結(jié)婚中較常見的一種婚配形式。隨著人類文明的進(jìn)步與科學(xué)的發(fā)展，人類對(duì)近親結(jié)婚的危害已有較深入的認(rèn)識(shí)，這一陋習(xí)逐漸被擯棄。但由于經(jīng)濟(jì)、宗教、歷史文化等原因，近親結(jié)婚在一些國家與地區(qū)仍然流行。有研究指出近來阿聯(lián)酋、卡塔爾、也門地區(qū)的近親結(jié)婚率呈上升趨勢(shì)，其中也門40%的婚姻都是近親婚姻，其中85%都是第一代的堂兄妹結(jié)婚，甚至這些近親結(jié)婚的當(dāng)事人大多有著較高的學(xué)歷和良好的家庭背景，大部分在經(jīng)濟(jì)部門工作［3］。

眾所周知，近親結(jié)婚會(huì)增加婚配子女的隱性遺傳病的發(fā)病率。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，目前所知的人類常染色體隱性遺傳病約1 730多種，每個(gè)人都攜帶有5～6個(gè)不同的隱性致病基因。在親緣之間，常攜帶相同的隱性致病基因，因此近親婚育后會(huì)增加隱性致病基因的純合概率，增加子女隱性遺傳病的發(fā)病率，且近親婚配的危險(xiǎn)程度與隱性遺傳病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，即：常染色體隱性遺傳病愈少見，非近親婚配子女的發(fā)病率愈低，而近親婚配的危險(xiǎn)性愈大［4-5］。三代旁系血親婚育子代的發(fā)病率是非近親婚育子代的6.25倍。最近Kelmemi等［6］對(duì)突尼斯國家患有常染色體隱性遺傳病的家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其中58%的患者為近親婚育后代。

近親結(jié)婚對(duì)子代男性生育力的影響鮮見報(bào)道。我們對(duì)3例三代旁系血親婚育子代的男性不育患者進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，3例患者均表現(xiàn)為嚴(yán)重的少弱精子癥和無精子癥，體格檢查未提示睪丸發(fā)育異常，且血清性激素水平（T、FSH、LH）均在正常范圍。近親婚育會(huì)增加隱性致病基因的純合概率，而Y 染色體AZF區(qū)基因缺失可導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯及生精障礙，因此我們進(jìn)一步對(duì)3例患者的外周血染色體核型及Y 染色體微缺失進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3例患者的染色體核型均為46，XY，并未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的異常，Y 染色體AZF 區(qū)均無微缺失，提示近親婚育子代不育并不是染色體核型及Y 染色體微缺失引起，二者可能并不影響男性的生殖內(nèi)分泌功能。

因此，這類患者嚴(yán)重少弱精子癥和無精子癥的原因值得進(jìn)一步關(guān)注和深入研究。已有研究報(bào)道，除Y 染色體上的相關(guān)基因?qū)影l(fā)生、發(fā)育有影響外，還有很多常染色體上的相關(guān)基因也對(duì)其產(chǎn)生一定作用［7-10］。Seboun等［11］通過對(duì)3 號(hào)染色 體上的DAZLA 基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該基因可能是常染色體隱性男性不育的致病基因。在生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中，常染色體的畸變可以導(dǎo)致減數(shù)分裂阻斷或部分阻斷，使精子生成阻滯在精母細(xì)胞水平而不能繼續(xù)分化成精子，繼而影響生精功能；亦可能在常染色體斷裂點(diǎn)或附近存在著精子發(fā)生相關(guān)基因的缺失或者突變，從而造成少精子癥或無精子癥，臨床上表現(xiàn)為男性不育［12］。

此外，有人發(fā)現(xiàn)近親婚育可能引起子代男性精子超微結(jié)構(gòu)的缺陷，造成不育。Baccetti等［13］對(duì)64例近親結(jié)婚兒子的精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，有17例（27%）存在精子超微結(jié)構(gòu)缺陷，而在1 506例對(duì)照組中僅發(fā)現(xiàn)15例（＜1%）存在精子超微結(jié)構(gòu)缺陷，并且近親婚育后代的精子活力較非近親婚育后代的低，這可能與這些患者存在遺傳基礎(chǔ)有關(guān)。Escalier等［14］研究報(bào)道了1例近親結(jié)婚子代的精子超微結(jié)構(gòu)，該患者67.5%的精子鞭毛缺失，全部精子缺少纖維鞘的中央?yún)^(qū)，并且這種纖維鞘異常尚未在其他哺乳動(dòng)物中報(bào)告，只在GAPDs基因敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)有這種現(xiàn)象［15］。Thépot等［16］通過基因工程敲除小鼠的JunD 基因，發(fā)現(xiàn)敲除JunD 基因后的小鼠在生育、性激素、精子畸形及精子頭部和尾部的超微結(jié)構(gòu)等多方面出現(xiàn)異常。另外，Latini等［17］對(duì)1例近親結(jié)婚子代的精子形態(tài)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在透射電鏡下可見精子尾部缺失、染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞質(zhì)微粒殘余，認(rèn)為這與近親結(jié)婚子代易發(fā)生基因突變從而造成精子遺傳障礙有關(guān)。上述研究提示我們可以在下一步實(shí)驗(yàn)中對(duì)該3例患者精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。

綜上所述，三代旁系血親婚育增加子代的不育風(fēng)險(xiǎn)，影響子代的精子數(shù)量、活力、畸形率及精子的超微結(jié)構(gòu)，這可能與父母近親結(jié)婚增加隱性致病基因的純和概率及基因變異等有關(guān)。

［1］ Simoni M，Bakker E，Eurlings MC，et al.Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions［J］.Int J Androl，1999，22：292-299.

［2］ Dada R，Gupta NP，Kucheria K.Molecular screening for Yq microdeletion in men with idiopathic oligozoospermia and azoospermia［J］.J Biosci，2003，28：163-168.

［3］ Jurdi R，Saxena PC.The prevalence and correlates of consanguineous marriages in Yemen：similarities and contrasts with other Arab countries［J］.J Biosoc Sci，2003，35：1-13.

［4］ 楚玉榮，宮凌濤，楚智慧.近親結(jié)婚的危害與遺傳病的發(fā)病率［J］.生物學(xué)教學(xué)，2004，2：57-58.

［5］ Tadmouri GO，Nair P，Obeid T，et al.Consanguinity and reproductive health among Arabs［J］.Reprod Health，2009，6：17.

［6］ Kelmemi W，Chelly I，Kharrat M，et al.Consanguinity and homozygosity among tunisian patients with an autosomal recessive disorder［J］.J Biosoc Sci，2015，29：1-9.

［7］ Dohle GR，Halley DJ，Van Hemel JO，et al.Genetic risk factors in infertile men with severe oligozoospermia and azoospermia［J］.Hum Repord，2002，17：13-16.

［8］ Wosnitzer MS，Paduch DA.Endocrinological issues and hormonal manipulation in children and men with Klinefelter syndrome［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2013，163C：16-26.

［9］ Aston KI.Genetic susceptibility to male infertility：news from genome-wide association studies［J］.Andrology，2014，2：315-321.

［10］ 姚桂梅，陳貴安.Y 染色體微缺失與男性不育研究進(jìn)展［J］.中華男科學(xué)，2002，8：445-448.

［11］ Seboun E，Barbaux S，Bourgeron T，et al.Gene sequence，location，and evolutionary conservation of DAZLA，a candidate male sterility gene［J］.Genomics，1997，41：227-235.

［12］ 涂向東，張寶珍.男性常染色體平衡易位三例［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2004，21：256.

［13］ Baccetti B，Capitani S，Collodel G，et al.Genetic sperm defects and consanguinity［J］.Hum Reprod，2001，16：1365-1371.

［14］ Escalier D，Albert M.New fibrous sheath anomaly in spermatozoa of men with consanguinity［J］.Fertil Steril，2006，86：219.e1-9.

［15］ Miki K，Qu W，Goulding EH，et al.Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S，a sperm-specific glycolytic enzyme，is required for sperm motility and male fertility［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101：16501-16506.

［16］ Thépot D，Weitzman JB，Barra J，et al.Targeted disruption of the murine junD gene results in multiple defects in male reproductive function［J］.Development，2000，127：143-153.

［17］ Latini M，Gandini L，Lenzi A，et al.Sperm tail agenesis in a case of consanguinity［J］.Fertil Steril，2004，81：1688-1691.