間充質祖細胞源性神經(jīng)元樣細胞肌內移植延緩骨骼肌萎縮

王麗娟 趙文勇

（1.西南藥業(yè)股份有限公司，中國 重慶 400038；2.重慶市公安局九龍坡區(qū)分局，中國 重慶 400039）

骨骼肌的失神經(jīng)性萎縮，是周圍神經(jīng)治療領域至今尚未解決的難題。既往研究表明：神經(jīng)干細胞直接注射于肌肉內，移植細胞可長期存活，且部分分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞，并有效延緩了失神經(jīng)性肌肉的萎縮[1-2]，然而足量的神經(jīng)干細胞獲得途徑有限且擴增困難，尋找新的移植細胞至關重要[3-4]。新近研究發(fā)現(xiàn)，間充質祖細胞具有易獲取、易生長、增殖能力強等特點，其體外誘導分化來源的神經(jīng)元樣細胞肌內移植能夠原位定植存活及很好地維持移植前神經(jīng)元及神經(jīng)膠質樣細胞的特性[5-7]。那么將這些神經(jīng)元樣細胞直接移植于靶肌肉內能否達到延緩失神經(jīng)性骨骼肌萎縮的作用呢？目前國內外文獻少見報道。基于此本研究進行了相關探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

GFP 轉基因C57 小鼠6 只，雌性，清潔級，3 周齡，質量（10±1）g；C57 小鼠36 只，雄性，清潔級，12 周齡，質量（20±1）g；由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學動物中心提供。動物使用許可證：SCXK(渝)2007-0004；環(huán)境許可證：XYXK（渝）2007-0004。

1.2 主要試劑

兔抗鼠α-actin、MHC、GAPDH抗體及羊抗兔IgG/TRITC二抗（Sigma公司）；兔抗鼠NSE（neurone specific enolase）、GFAP（glial fibrillary acidic protein）抗體及羊抗兔熒光二抗均購自北京博奧森生物技術有限公司；蛋白提取液（Pierce 公司）；RNAiso Reagent、RNA PCR Kit(AMV)ver.3.0（TaKaRa 公司）；肌細胞生成素擴增引物為5′-TGGAGCTGTATGAGACATCCC-3′，5′-TGGACAATGCTCAGGGGTCCC-3′，磷酸甘油醛脫氫酶擴增引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，MyoD擴增引物為：5′-GCCCGCGCTCCAACTGCTCTGAT-3′，5′-TCTTTTGGGCGTGAAGAACCAG-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 GFP-MPC 的分離、培養(yǎng)及鑒定

取GFP 轉基因C57 小鼠后肢長骨，MPC 的分離、培養(yǎng)、體外誘導及鑒定方法參考文獻[7]。

1.4 小鼠腓腸肌失神經(jīng)支配模型的制備[8]

C57 小鼠隨機分為MPC 移植組、神經(jīng)斷離組及對照組，每組12只。小鼠腓腸肌失神經(jīng)支配模型制備方法參照文獻[6]；對照組不作任何處理。術后2 和4 周，每組隨即取6 只小鼠斷頸處死并提取雙側小腿腓腸肌作實驗觀察。

1.5 GFP-MPC 體內移植

選取第3 代GFP-MPC 進行神經(jīng)元樣細胞誘導分化及鑒定后收集細胞，用PBS 調整細胞濃度至5×105/μL。5μL 緩慢散點注于MPC 移植組腓腸肌內，神經(jīng)斷離組對應部位同法注入等量PBS；對照組不作任何處理。

1.6 觀察指標

（1）一般情況：觀察小鼠后肢活動能力情況。

（2）GFP-MPC 肌內移植存活情況及自身特性的鑒定：切取GFPMPC 注射部位周圍肌肉行組織連續(xù)冰凍切片，利用GFP 轉基因小鼠體細胞自發(fā)綠色熒光的特點，熒光顯微鏡下觀察移植細胞存活情況。利用免疫熒光檢測神經(jīng)元特異性標記物NSE，熒光顯微鏡下觀察，以細胞質發(fā)出紅色熒光者為陽性細胞。

（3）腓腸肌濕重維持率測定：完整切去左右側腓腸肌稱重，右側除以左側，計算腓腸肌濕重維持率。

（4）肌纖維橫截面積維持率的測定：取小鼠雙側后肢腓腸肌中份肌腹行組織冰凍切片，HE 染色，采用VDSⅢ型半自動圖像分析儀（A.M.S 公司）測量肌纖維橫截面積（cross section area，CSA），右側除以左側，計算其維持率。

（5）超微結構觀察：右后肢腓腸肌中份肌腹切取少量組織進行超薄切片，用JEM-12OOEX 透射電鏡觀察退變的肌細胞核、線粒體、內質網(wǎng)、肌絲肌節(jié)的形態(tài)及膠原纖維的變化。

（6）Western blot 檢測α-actain、MHC 的表達：參照說明書提取肌肉總蛋白質，經(jīng)過電泳、半干法電轉膜及封閉后，兔抗鼠α-actain/MHC、羊抗兔IgG 分別與膜37℃溫育，間以洗膜，終以化學發(fā)光試劑盒顯影、定影及攝片，最后在凝膠成像系統(tǒng)下分析處理，灰度掃描進行半定量分析。

（7）RT-PCR 檢測Myogenin、MyoD 的基因表達：參照說明書提取肌肉總RNA 并進行反轉錄，常規(guī)方法進行PCR 及凝膠電泳，最后在紫外透射儀下掃描圖像，采用Quantity one 圖像分析軟件進行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t 檢驗。

2 結果

2.1 一般情況

隨著治療時間的延長，MPC 移植組小鼠右后肢活動功能逐漸恢復，術后4 周接近正常。

2.2 GFP-MPC 肌內移植存活情況及自身特性的鑒定

GFP-MPC 移植組注射部位周圍腓腸肌可見發(fā)綠色熒光的細胞均勻分布于肌纖維間隙，部分細胞伸出軸突樣的突起，部分細胞間通過突起互相連接（圖1A）；對照組肌內未見確切發(fā)綠色熒光的細胞（圖1B）。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)：GFP-MPC 移植組陽性表達NSE(胞質發(fā)出紅色熒光)（圖1C），而神經(jīng)斷離組對應肌肉組織中無陽性表達細胞（圖1D）。這表明MPC 源性神經(jīng)元樣細胞移植于失神經(jīng)支配靶肌肉中可定植存活，并能夠很好地維持移植前自身特性。

圖1 移植細胞原位存活情況及神經(jīng)元特異性標志物的表達情況

2.3 肌肉濕重及肌纖維橫截面積維持率變化

術后2 和4 周，MPC 移植組小鼠腓腸肌濕重、肌纖維橫截面積維持率均顯著高于神經(jīng)斷離組（n=6）（圖2）。

圖2 肌肉濕重及肌纖維橫截面積維持率的變化

2.4 組織學觀察

2.4.1 HE 染色

術后4 周，神經(jīng)斷離組骨骼肌細胞胞漿明顯固縮，核內移現(xiàn)象普遍，細胞核變性（核染色質異染、缺失、核變小、甚至固縮）增多，染色加深，肌纖維排列紊亂，無方向性，肌纖維直徑及橫截面積明顯縮小，膠原纖維明顯增多。GFP-MPC 移植組明顯優(yōu)于神經(jīng)斷離組，與對照組比較，肌纖維排列欠整齊，胞體偏小且大小不一，少量細胞仍可見細胞核變性現(xiàn)象，膠原纖維略有增加（圖3 A、B、C）。

2.4.2 超微結構變化

術后4 周，與神經(jīng)斷離組比較，GFP-MPC 移植組細胞核明顯增大、核質染色均勻，異染色質發(fā)達；線粒體數(shù)量增多，腫脹不明顯，線粒體脊較多，形狀相對正常；內質網(wǎng)擴張少；肌絲肌節(jié)排列整齊，橫紋清晰，無明顯的融合；肌纖維間隙膠原纖維量少；與對照組比較，GFPMPC 移植組細胞核明顯增大，核仁增大且明顯，異染色質發(fā)達，核內移動現(xiàn)象普遍，線粒體數(shù)量增多，但肌絲肌節(jié)形態(tài)偏小(圖3 D、E、F)。

圖3 治療對腓腸肌形態(tài)學的影響

2.5 肌動蛋白和肌球蛋白的表達

術后4 周，MPC 移植組肌動蛋白、肌球蛋白的表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組和對照組（n=6）（圖4）。

圖4 治療對小鼠肌動蛋白和肌球蛋白的影響

2.6 RT-PCR 檢測Myogenin、MyoD 基因表達

術后4 周，MPC 移植組MyoD 的基因表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組及對照組，Myogenin 基因表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組；對照組未發(fā)現(xiàn)明顯Myogenin 基因表達（n=6）（圖5）。

圖5 治療對肌肉Myogenin 和MyoD 表達的影響

3 討論

盡管神經(jīng)干細胞移植于受損的神經(jīng)內或注入靶肌肉中均能有效延緩失神經(jīng)性肌肉的萎縮，但其獲得途徑有限且擴增困難，因此尋找新的移植細胞仍然至關重要。新近研究發(fā)現(xiàn)，間充質祖細胞體外誘導分化來源的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質樣細胞移植于失神經(jīng)支配靶肌肉中可原位定置存在，并能夠很好地表達其移植前自身特性[7]。那么，從理論上推測：將間充質祖細胞源性神經(jīng)元樣細胞直接移植于失神經(jīng)支配靶肌肉中，亦可能達到延緩骨骼肌萎縮作用，為此，我們進行了該方面研究。

我們研究發(fā)現(xiàn)：隨著治療時間的延長，小鼠右后肢活動功能逐漸恢復并接近正常；原位定植存活的移植細胞均勻分布于肌細胞間隙且部分細胞陽性表達神經(jīng)元特異性標志物（NSE）；肌纖維、肌絲肌節(jié)的排列尚整齊且肌細胞核、線粒體、內質網(wǎng)的退變及肌肉纖維化的程度明顯優(yōu)于神經(jīng)斷離組，肌細胞形態(tài)與正常對照組較為接近；肌肉濕重、肌纖維橫截面積維持率的下降幅度及α-actin、MHC 的降解速度均顯著低于神經(jīng)斷離組；這表明間充質祖細胞源性神經(jīng)元樣細胞靶肌內移植可有效延緩失神經(jīng)性骨骼肌萎縮，其治療效果與MPC 直接移植于神經(jīng)離斷處較為一致[9]；由于神經(jīng)損傷，肌肉仍處于失神經(jīng)支配狀態(tài)，足量的神經(jīng)營養(yǎng)作用的喪失致使骨骼肌最終走向萎縮的結局難以改變，但可以有效的為神經(jīng)再生爭取了時間，并可為神經(jīng)再支配后肌肉功能恢復提供了更好的骨骼肌結構基礎。

既往研究表明，肌衛(wèi)星細胞(muscle satellite cells)是具有增殖和自我更新能力的成肌前體細胞或單能成肌干細胞，這種組織特異的祖細胞在出生后骨骼肌的損傷、修復和維持中起著重要的作用[10]，但肌衛(wèi)星細胞的激活和成肌分化受MyoD 家族的bHLH 轉錄因子調控，其中MyoD 決定著肌衛(wèi)星細胞是否能激活成為具有成肌特性的肌肉干細胞，而Myogenin 則發(fā)揮著調節(jié)肌肉干細胞終末分化為肌管肌纖維的功能[11]。此外，大量動物實驗發(fā)現(xiàn)：成體骨骼肌一旦失神經(jīng)支配，所有成肌調節(jié)因子的表達均上調，尤其是Myogenin 的高表達可啟動一系列骨骼肌特異的胚胎性受體和收縮蛋白的合成，而這些胚胎性蛋白的表達是失神經(jīng)骨骼肌接受神經(jīng)再支配的必要前提[12]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，術后4 周，MPC 移植組MyoD 表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組和對照組，Myogenin 基因表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組，對照組未發(fā)現(xiàn)Myogenin基因明顯表達。因此，推測間充質祖細胞源性神經(jīng)元樣細胞肌內移植延緩骨骼肌萎縮的可能機制是：定植存活的神經(jīng)元樣細胞分泌了骨骼肌所必需的某些神經(jīng)營養(yǎng)因子，致使處于靜止狀態(tài)的肌衛(wèi)星細胞被激活并成肌分化產(chǎn)生大量的新生肌纖維抑或直接抑制了肌細胞的萎縮，進而肌肉濕重、肌肉蛋白含量及肌纖維橫截面積得以維持，但其具體作用機制仍有待進一步實驗研究。

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