脾臟免疫細(xì)胞在胃潰瘍期間的變化及作用

脾臟免疫細(xì)胞在胃潰瘍期間的變化及作用

張江蘭張敏1邢琛琨任君旭張靜吳靖芳

(河北北方學(xué)院，河北張家口075000)

摘要〔〕目的探討實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠脾臟樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞(Mφ)和T細(xì)胞的變化和作用。方法胃前壁胃黏膜下注射冰乙酸制備大鼠胃潰瘍模型，免疫組織化學(xué)檢測(cè)正常組(5只)、鹽水組(28只)和潰瘍組(35只)雄性大鼠脾臟DC、Mφ和T細(xì)胞的變化。結(jié)果潰瘍組、鹽水組和正常組相比，DC、Mφ和T細(xì)胞數(shù)量均增多。潰瘍2～10 d組DC數(shù)密度值逐漸增多,14 d后其值略有降低，其中6 d其值與鹽水組相比差異顯著(P<0.05)，6～14 d各組其值與正常組相比差異顯著(P<0.05，P<0.01)；潰瘍組2～4 d組Mφ數(shù)密度值逐漸增多，6～14 d其值逐漸降低，各組其值均高于鹽水組和正常組(P<0.05，P<0.01);潰瘍組2～6 d T細(xì)胞數(shù)密度值持續(xù)增多,10 d后其值逐漸降低，其中4～10 d組其值與正常組相比差異顯著(P<0.01)。結(jié)論DC和T細(xì)胞在潰瘍期間脾臟中數(shù)量增多，通過提高脾臟免疫反應(yīng)性促進(jìn)胃潰瘍愈合；潰瘍期間Mφ數(shù)量增多，提示Mφ在潰瘍形成和自愈機(jī)制中起一定的作用。

關(guān)鍵詞〔〕胃潰瘍；樹突細(xì)胞； 巨噬細(xì)胞；T細(xì)胞；免疫組化

中圖分類號(hào)〔〕R573.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：張家口市科技攻關(guān)計(jì)劃(12110065G-1)；河北北方學(xué)院自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.2001022)

通訊作者：任君旭(1966-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事潰瘍病研究。

1張家口學(xué)院

第一作者：張江蘭(1981-)，女，講師，主要從事潰瘍病研究。

一般認(rèn)為胃潰瘍是胃黏膜攻擊因子相對(duì)增強(qiáng)或防御因子相對(duì)減弱,二者失衡所引起。胃潰瘍愈合不是孤立的，它受全身神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)。脾臟作為全身最大的周圍淋巴器官，是機(jī)體神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中心的一個(gè)重要組成部分，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中有著重要的不可替代的作用，擁有大量淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞(Mφ)等免疫細(xì)胞，是其執(zhí)行免疫功能的基礎(chǔ)。本文探討胃潰瘍期間脾臟DC、 Mφ和T細(xì)胞改變?cè)谖笣冃纬珊妥杂^程中的免疫調(diào)節(jié)作用。

1材料和方法

1.1動(dòng)物與分組8周齡SD雄性大鼠共68只。大鼠分為實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍組(潰瘍組)35只，鹽水組28只，正常組5只，體重180～220 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買。

1.2大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型的制作及取材潰瘍組大鼠按冰乙酸制實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型方法〔1〕，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉。胸腹部剃毛、消毒，在無菌條件下暴露胃。在胃前壁近胃竇處將0.01 ml 冰醋酸注入胃黏膜下層。將大網(wǎng)膜覆蓋于注射區(qū)后，逐層縫合腹壁切口。鹽水組模擬手術(shù),注射等量生理鹽水代替冰醋酸。正常組不作任何處理。取材前禁食12 h，不限飲水。動(dòng)物被麻醉后，迅速開胸，主動(dòng)脈插管，剪開右心耳，首先灌注生理鹽水100 ml，繼之灌注4% 多聚甲醛250 mL，維持20 min。在造模后2、4、6、10和14 d分批取材，從脾截取1 cm長(zhǎng)組織條，置于Bouin液中固定18～24 h，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚4 μm，裱貼于涂有APES的載玻片，行HE染色和免疫組化染色。

1.3HE染色切片經(jīng)脫蠟、染色、脫水、透明和封片，進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.4免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行檸檬酸緩沖液(pH6.0)92℃～98℃水浴鍋修復(fù)10 min，室溫冷卻；作定位研究的鄰片以檸檬酸緩沖液(pH6.0)高壓修復(fù)5 min，室溫冷卻；30 g/L H2O2-甲醇室溫20 min，100 g/L正常羊血清室溫孵育30 min，傾去多余的血清，滴加兔抗大鼠CD3多克隆抗體(工作濃度為1∶100)、兔抗大鼠S-100多克隆抗體(工作濃度為1∶100)和兔抗大鼠Lysozyme多克隆抗體(工作濃度為1∶150)，購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，4℃濕盒中過夜；滴加生物素標(biāo)記Ⅱ抗，37℃孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃孵育30 min；DAB-H2O2液顯色后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。正常兔血清代替一抗作陰性對(duì)照，余步驟相同。

1.5形態(tài)計(jì)量和圖像分析用OLYMPUS-CX31顯微鏡連接MiE顯微圖像處理軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行觀察；在光鏡下觀察S-100和Lysozyme陽性反應(yīng)物呈棕黃色顆粒狀分布于各細(xì)胞的胞質(zhì)中，CD3陽性反應(yīng)物呈棕黃色顆粒狀分布于各細(xì)胞的胞膜，分別以胞質(zhì)內(nèi)和胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞。用成像系統(tǒng)在顯微鏡下隨機(jī)圈定面積，每只動(dòng)物隨機(jī)圈定10個(gè)面積，在高倍鏡下計(jì)數(shù)所選區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)，通過計(jì)算陽性細(xì)胞的數(shù)密度對(duì)各組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；陽性細(xì)胞數(shù)密度(NA)=陽性細(xì)胞數(shù)目/所選面積。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0 軟件行ANOVA方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1脾臟DC在胃潰瘍期間的變化在正常脾臟中DC多為分枝形，主要分布于B細(xì)胞區(qū)和邊緣區(qū)，動(dòng)脈周圍淋巴鞘和紅髓中也有少量散在分布；在動(dòng)脈周圍淋巴鞘和B細(xì)胞區(qū)的體積較大，突起較粗、長(zhǎng)；邊緣區(qū)有DC呈環(huán)行排列。潰瘍組與鹽水組和正常組相比DC數(shù)量均增多(圖1)。潰瘍2～10 d組B細(xì)胞區(qū)DC越來越密集，動(dòng)脈周圍淋巴鞘DC增多，邊緣區(qū)DC密集、數(shù)量增多明顯，在10 d其NA值達(dá)到最高值，從14 d后逐漸減少，但仍維持在一個(gè)較高的水平。其中6 d NA值與前一潰瘍組和鹽水組的相比顯著增高(P<0.05)，6～14 d各組NA值與正常組的相比顯著增高(P<0.05或P<0.01)。而鹽水組的變化趨勢(shì)與潰瘍組一致，脾臟各部位DC數(shù)量與潰瘍組相比數(shù)量少，分布稀疏，10 d與正常組相比NA值明顯增高(P<0.05)。見表1。

2．2脾臟Mφ在胃潰瘍期間的變化脾臟Mφ主要分布于紅髓，邊緣區(qū)也有少量分布，白髓中分布很少。潰瘍各組Mφ數(shù)量與對(duì)照組和正常組相比均顯著增多(P<0.05或P<0.01)(圖2)。潰瘍2～4 dMφ數(shù)密度值持續(xù)增多明顯高于對(duì)照組和正常組(P<0.01)，以紅髓中變化最明顯；6～14 d其NA值稍微逐漸降低10 d后NA值逐漸降低，但仍明顯高于對(duì)照組和正常組(P<0.01)。對(duì)照組變化趨勢(shì)與潰瘍組一致，其中2～10 d各組與正常組相比差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表2。

鹽水組　　　　　　　　　　　潰瘍組 圖1　鹽水組和潰瘍組脾臟DC細(xì)胞分布(IHC，×400)

組別n2d4d6d10d14d潰瘍組571.8±19.375.3±7.493.3±18.01)2)3)97.7±21.91)87.2±20.81)2)鹽水組2864.2±14.171.4±16.578.0±16.486.5±16.869.4±12.4正常組3555.5±13.355.5±13.355.5±13.355.5±13.355.5±13.3

與正常組比較:1)P<0.05；與相應(yīng)鹽水組比較：2)P<0.05；與前一潰瘍組比較：3)P<0.05，下表同

2.3脾臟T細(xì)胞在胃潰瘍期間的變化正常脾臟T細(xì)胞主要分布于脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘，邊緣區(qū)和紅髓中也有散在分布。潰瘍組與鹽水組和正常組相比各組T細(xì)胞數(shù)量均增多(圖3)。在潰瘍組2～6 d T細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增多，在6 d組NA值達(dá)到高峰，在10 d組NA值略微有所降低，14 d降低顯著(與10 d相比P<0.05)但仍高于鹽水組，其中潰瘍4～10 d組NA值與正常組的相比差異性顯著(P<0.01)。潰瘍組以脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘T細(xì)胞數(shù)量增加最為顯著；邊緣區(qū)T細(xì)胞在2 d增加明顯，而后逐漸減少；紅髓T細(xì)胞在損傷后逐漸增加，在14 d也維持在一個(gè)較高水平。鹽水組從術(shù)后2 d開始T細(xì)胞數(shù)量逐漸緩慢增高，在14 d維持在一個(gè)較高的水平。見表2。

鹽水組　　　　　　　　　　　潰瘍組 圖2　鹽水組和潰瘍組脾臟Mφ細(xì)胞分布(IHC,×400)

鹽水組　　　　　　　　　　　潰瘍組 圖3　鹽水組和潰瘍組脾臟T細(xì)胞分布(IHC，×400)

組別n Mφ T細(xì)胞 2d4d6d10d14d2d4d6d10d14d潰瘍組575.6±25.81)2)82.8±19.71)2)70.4±29.21)2)67.7±31.31)2)43.0±27.71)2)218.0±61.2322.4±51.81)2)3)358.9±121.31)2)346.6±22.61)2)249.8±39.93)鹽水組2838.4±13.459.6±17.92)3)53.3±11.848.4±9.32)31.9±15.1209.8±71.2229.2±67.8239.4±51.5219.3±34.4205.3±47.0正常組3525.5±11.325.5±11.325.5±11.325.5±11.325.5±11.3190.2±28.9190.2±28.9190.2±28.9190.2±28.9190.2±28.9

3討論

抗原提呈細(xì)胞能通過激活、誘導(dǎo)靜息型T細(xì)胞的分化，引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答或免疫耐受，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者。DC和Mφ是最重要的專職抗原呈遞細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵的引導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。脾臟DC大部分為未成熟DC ，具有活性的成熟DC含量較少。未成熟DC在機(jī)體受到刺激，攝取抗原后，逐漸成熟，抗原提呈能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化為成熟DC。S-100蛋白通常為未成熟DC的標(biāo)志物〔2〕。本文結(jié)果提示胃潰瘍期間大鼠免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)機(jī)制明顯增強(qiáng)。DC呈S-100蛋白陽性，通過S-100蛋白調(diào)節(jié)T細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度,具有很強(qiáng)的提呈抗原和刺激T細(xì)胞的能力〔3〕；DC與B細(xì)胞通過CD40L-CD40耦聯(lián)和上調(diào)B7分子直接刺激B細(xì)胞產(chǎn)生大量IgG和IgM，增強(qiáng)體液免疫。同時(shí)，DC 通過在體內(nèi)遷移而發(fā)揮強(qiáng)大的抗原提呈功能，從外周非淋巴組織遷移進(jìn)入次級(jí)淋巴組織〔1〕，如心臟、腎臟間質(zhì)中的DC在局部獲取抗原后通過血液到脾臟，DC移行到脾臟T細(xì)胞區(qū)定居下來〔4，5〕，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在本實(shí)驗(yàn)制作的胃潰瘍模型中，在胃潰瘍形成時(shí)期主要由于冰乙酸的刺激，使胃黏膜DC大量處理抗原，隨淋巴細(xì)胞再循環(huán)到達(dá)脾臟，首先引起邊緣區(qū)的改變，向動(dòng)脈周圍淋巴鞘胞遷移，并在動(dòng)脈周圍淋巴鞘定居下來誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示潰瘍組CD3+T細(xì)胞數(shù)量均增高，且以動(dòng)脈周圍淋巴鞘數(shù)量增多最為顯著，并存在激烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

脾臟是Mφ的主要儲(chǔ)存器官，Mφ是專職的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體非特異性和特異免疫中都起著重要的作用，能將加工、處理后的抗原肽通過表面的MHC分子傳遞給T細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。溶菌酶(Lysozyme)是Mφ的標(biāo)志性表達(dá)產(chǎn)物〔6〕。本文發(fā)現(xiàn)潰瘍各組Mφ數(shù)量明顯增多，主要分布于紅髓髓索中。Mφ是構(gòu)成血脾屏障的主體細(xì)胞，可以在脾索的間隙中移行、捕捉、吞噬衰老的紅細(xì)胞、異物和抗原物質(zhì)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2～4 d組Mφ數(shù)密度值逐漸升高，而6 d后其值逐漸降低，但仍維持在高水平。本組曾證實(shí)〔8〕在胃潰瘍期間Mφ吞噬功能增強(qiáng)，處理紅細(xì)胞速度加快，說明Mφ處于激活狀態(tài)，Mφ激活后可受多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而合成NO，高水平的NO 可以產(chǎn)生細(xì)胞毒作用〔9〕。有研究顯示被激活的Mφ含有大量的Mφ移動(dòng)抑制因子〔10〕可損傷胃黏膜細(xì)胞，而脾臟Mφ在胃潰瘍形成和愈合過程中是參與潰瘍黏膜的修復(fù)，還是參與潰瘍的形成，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

總之， DC、Mφ和T細(xì)胞是非常重要的免疫細(xì)胞，各細(xì)胞在體內(nèi)的分布和數(shù)量與疾病過程密切相關(guān)。DC和T細(xì)胞對(duì)提高潰瘍期間脾臟的免疫反應(yīng)性以促進(jìn)潰瘍的愈合起到了重要的作用，而潰瘍期間Mφ數(shù)量的改變，提示Mφ在潰瘍的形成和自愈機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。

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〔2014-09-18修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)