miR-18a在老年胃癌患者血清中的表達及意義

miR-18a在老年胃癌患者血清中的表達及意義

湯光華張英志

(嘉興市第一醫院消化科，浙江嘉興314000)

摘要〔〕目的探討胃癌患者血清microRNA-18a表達變化及其臨床診斷意義。方法采用實時熒光定量PCR檢測52例老年胃癌患者和33例健康體檢者血清miR-18a表達水平。通過分析受試者工作特征曲線(ROC)判斷miR-18a表達水平在胃癌診斷中的靈敏度和特異度。酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測患者血清腫瘤標記物水平。結果胃癌患者血清miR-18a較健康對照組高(P<0.05)。血清miR-18a水平與患者年齡、性別無關(P>0.05)，與分化程度、臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移明顯相關(P<0.05或P<0.01)。ROC分析結果顯示最佳的miR-18a相對表達量的臨界值為2.77，診斷靈敏度77.2%，特異度82.8%，ROC曲線下面積為0.791。血清miR-18a 水平與胃癌相關抗原MG7-Ag明顯正相關，與糖抗原(CA)-72-4、CA-50和甲胎蛋白(AFP)正相關，與癌胚抗原(CEA)無明顯相關性。結論miR-18a在胃癌患者血清中水平升高，作為新的血清學指標在胃癌篩查診斷中有重要參考價值。

關鍵詞〔〕胃癌；miR-18a；實時熒光定量PCR；診斷

中圖分類號〔〕R735〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：湯光華(1975-)，男，主治醫師，主要從事老年性疾病血清標志物檢測及輔助診斷研究。

微小RNA(miRNA)參與了人類基因組中約1/3基因的表達調控，廣泛參與細胞的生物學過程，包括細胞生長、分化、凋亡甚至腫瘤的發生、發展及轉移過程，特異性的miRNA發揮著重要的作用〔1〕。在血液中檢出腫瘤特異性miRNA并將其作為腫瘤生物學標志對于腫瘤早期診斷及預后判斷具有重要意義〔2〕。在胃癌(GC)組織中具有特異性的miRNA表達譜〔3〕，其中miR-18a特異性高表達〔4〕。本研究通過檢測GC患者血清miR-18a水平變化，探討其臨床診斷意義。

1資料與方法

1.1研究對象選擇2010年1月至2013年12月本院經手術病理證實的老年GC患者52例，收集患者確診時采集的血清樣本，其中男33例，女19例，年齡62～79〔平均(68±8.2)〕歲。采用2010年國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會(UICC/AJCC)TNM分期標準分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期26例，Ⅲ期8例，Ⅳ期6例。所有患者排除其他腫瘤或病毒感染疾病，入組患者在采集血液標本前均未經手術、放療以及化療。同期33例健康體檢者作為正常對照組。兩組年齡、性別比較無統計學差異，具有可比性(P>0.05)。在采集樣本前均獲得患者或家屬的知情同意。

1.2主要試劑和儀器RNA提取試劑盒TRIZOL Reagent，美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒iScriptcDNA synthesis kit以及實時熒光定量PCR試劑盒iQTMSYBR?Green Supermix，美國Bio-Rad公司；運用Primer Premier 5.0軟件設計miRNA-18a和U6的特異性引物，miRNA-18a正義引物：5′TGTCGGGTAGCTTATCAGAC3′，反義引物：5′TTCAGACAGCCCATCGACTG3′;U6正義引物：5′CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 3′，反義引物：5′ ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC 3′，均由上海生工生物工程有限公司合成。在Bio-Rad iQ5定量PCR儀器上進行反應。紫外分光光度計NanoDrop ND-1000(NanoDrop，Wilmington，美國)。

1.3方法

1.3.1血清標本采集及總RNA提取收集清晨空腹外周血5 ml，室溫靜置30 min后取1.0 ml上清液，4℃、820 r/min離心10 min；取上層血清至新的離心管中，4℃、16 000 r/min離心10 min，取上清液到新的離心管中，置于-80℃冰箱中保存備用。樣本血清總RNA提取方法完全按照RNA提取試劑盒TRIZOL Reagent的操作說明進行?？俁NA濃度和純度利用紫外分光光度計NanoDrop ND-1000進行測定?？俁NA提取的質量利用1%變性瓊脂糖凝膠電泳進行分析。獲得的符合濃度和質量要求的RNA溶液保存于-80℃備用。

1.3.2miRNA逆轉錄和熒光定量PCR檢測血清miR-18a表達量按照反轉錄試劑盒說明書將1 μg 總RNA反轉錄為cDNA，主要反應條件：25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。以合成的cDNA為模板，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR。第1步，95℃預熱3 min；第2步，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環。熔解曲線分析0.5℃/0.5 min：55℃～95℃。同時以U6小核RNA(snRNA)管家基因作為內參照。結果在Bio-Rad熒光定量PCR-iQ5軟件進行分析。每個miRNA的相對表達量用2-△△Ct表示，ΔΔCt=(CtHCC-miR18a-CtHCC-U6)-(CtNC-miR18a-CtNC-U6)。每個樣本重復3次試驗。

1.3.3腫瘤標記物的檢測采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測患者血清GC抗原(MG7-Ag)，糖抗原(CA)-72-4、CA-50、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)的水平。

1.4統計學方法應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。通過受試者工作特征曲線(ROC)判斷miRNA-18a表達水平在GC診斷中的靈敏度和特異度。

2結果

2.1血清miR-18a在GC患者及正常組織中的表達miR-18a在GC患者血清內的相對水平是健康對照組的(2.57±0.46)倍(P<0.05)。

2.2血清miR-18a水平與臨床病理參數的關系血清miR-18a水平與患者年齡、性別無關(P>0.05)，與分化程度、臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移明顯相關(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.3血清miR-18a 水平對GC的診斷價值ROC曲線下面積(AUC)為0.791(95%CI0.715～0.901)。見圖1。根據ROC分析，最佳的miR-18a相對表達量的臨界值為2.77，診斷靈敏度76.9%，特異度82.6%。

表1　血清miR-18a水平與臨床病理參數的關系

圖1　血清miR-18a診斷胃癌的ROC

2.4血清miR-18a 水平與腫瘤標記物在GC中相關性分析血清miR-18a 水平與GC相關抗原MG7-Ag明顯正相關(r=0.787,P=0.008)，與CA-72-4、CA-50和AFP正相關(分別r為0.335、0.216、0.431，均P<0.05)，與CEA無明顯相關性(r=0.052，P=0.134)。

3討論

miRNA通過與mRNA 3′端非翻譯區互補結合，誘導mRNA斷裂，抑制翻譯過程，或者通過miRNA脫腺苷作用介導mRNA降解，在轉錄后水平調節基因表達〔5〕。由于miRNA序列、結構、豐度和表達方式的多樣性，決定了其在人類腫瘤信號通路中所起到的重要作用，參與腫瘤的發生、發展以及預后〔6〕。

目前多項研究發現，不同腫瘤組織中有其特異性的miRNA表達譜〔7～9〕；但組織中miRNA檢測的取材需要經過手術或者穿刺，對篩查、監測和診斷有一定的不便之處，對老年患者尤其不便。目前有研究表明〔2〕，miRNA在血清和血漿中也可能有穩定的表達，血清或血漿放置在常溫或在強酸強堿環境中以及反復冰凍及融解樣本不影響miRNA的穩定性；血漿中miRNA耐核糖核酸酶，非常穩定，并且血漿和血清中的樣本檢測有很好的相關性，都很適合作為血液基礎的標記物。腫瘤患者某些外周血miRNA升高的原因可能是在腫瘤組織中超表達的miRNA以一定的方式釋放入外周血中，具有腫瘤特異性，有可能作為一種新型的特異性腫瘤標志物〔10，11〕。

本研究結果提示血清miR-18a可能是GC的一個重要血清指標，對早期無癥狀GC的診斷有一定指示作用。并且miR-18a可能在GC的進展中起到重要作用，其水平變化可以作為腫瘤進展的觀測指標，對GC的篩查和早期診斷有一定的參考意義。通過分析ROC及血清miR-18a 水平與腫瘤標記物在GC中的相關性進一步證明，血清miR-18a可能是GC的一個重要血清指標，對早期無癥狀GC的診斷有一定指示作用。

4參考文獻

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〔2014-05-16修回〕

(編輯袁左鳴)