GC-MS法分析比較兩種處理方式所得酵母細胞自溶成分

趙 巍， 孫 喆， 鄭艷秋， 趙小麗， 甄玉國，2*

（1.吉林農業大學吉農博瑞奶牛飼料研發中心，吉林長春 130118；2.長春博瑞飼料集團有限公司技術中心，吉林長春 130114）

酵母細胞自溶物是指酵母細胞內的物質經過物理或化學手段使細胞內部釋放的物質，其成分復雜，包括糖類、蛋白質、氨基酸、有機酸、無機鹽、酶類、核酸、B族維生素等（李祥等，2001）。

酵母細胞自溶物具有降血壓、降血脂、促進傷口愈合、促進動物和微生物生長等多種生理活性作用。研究這些化學成分，對于進一步闡明酵母細胞代謝過程和調控機制有重要的意義。本試驗利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）分析酵母細胞自溶物的乙酸乙酯萃取物，比較不同促溶劑所得酵母細胞自溶物所含揮發性成分的差別，初步探討酵母細胞自溶物的主要化學成分，以為酵母細胞代謝的基礎研究積累數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及藥品來源 發酵罐，上海百侖生物有限公司；氣相色譜質譜儀，安捷倫公司；水浴鍋，無錫市蘇德試驗設備有限公司；pH計，上?？茣钥茖W儀器有限公司；氯化鈉，北京北化有限公司；木瓜蛋白酶，武漢萬榮科技發展有限公司。

1.2 樣品采集與處理 取高密度發酵所得酵母發酵液 （菌體密度為干重46.12 g/L），5000 r/min離心后得到的菌體用蒸餾水洗滌3次后，所得菌體按照以下條件進行自溶。

以NaCl為促溶劑的自溶條件：添加與酵母菌體濕重同等重量的蒸餾水，添加酵母細胞干重9%的NaCl，調節pH為5.0，控制溫度40℃ 12 h，50 ℃ 24 h，60℃ 12 h。

以木瓜蛋白酶為促溶劑的自溶條件：添加與酵母菌體濕重同等重量的蒸餾水，添加酵母細胞干重1%的木瓜蛋白酶，調節pH為6.0，控制溫度55℃ 48 h。

自溶結束后置于85℃水浴保持15 min滅酶活，5000 r/min離心10 min，上清液即為酵母細胞自溶液。

取10 mL酵母細胞自溶液，置于分液漏斗中，加入2倍量乙酸乙酯，充分振搖，靜置，待分層后吸取上清液，重復兩次，將乙酸乙酯層揮干后用1 mL丙酮定容，密封，4℃儲存，測定時10000 r/min離心5 min，取上清液直接注入氣相色譜與質譜聯用儀器進行分析。

1.3 儀器與測定條件 儀器：氣相色譜GC7890/質譜MS5970聯用儀（美國安捷倫公司）。

氣相條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫70℃（保留5 min），以4℃/min升溫至100℃，保持5 min；以10℃/min升溫至150℃，保持10min；以5℃/min升溫至240℃，保持8 min；以10℃/min升溫至270℃，保持5 min；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓 7.62 psi，載氣流量 1.0 mL/min；進樣量 1 μL；分流比 10∶1，溶劑延遲時間 3 min。

質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；接口溫度280℃；質量范圍20～800 amu。譜圖檢索：Nist11譜庫（Thompson 等，1997）。

2 結果與分析

對不同促溶劑所得酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物進行GC-MS分析。通過MSD化學工作站，Nist11質譜圖庫進行鑒定。按峰面積歸一化法進行計算求得各化學成分在樣品中的相對含量。由表1可知，以NaCl為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物共分離出49種化合物，鑒定了其中28種化學成分，相對總量為92.14%，總離子流圖見圖1。以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物共分離出49種化合物，鑒定了其中27種化學成分，相對總量為91.006%，見表1，總離子流圖見圖2。

圖1 以NaCl為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物總離子流圖

圖2 以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物總離子流圖

3 討論與結論

酵母細胞自溶物的成分極其復雜，本試驗通過萃取的方式去除酵母細胞自溶物中大分子物質（蛋白質、多肽、多糖等），保留中極性小分子物質。通過GC-MS分析添加不同促溶劑 （NaCl和木瓜蛋白酶）所得酵母細胞自溶物的乙酸乙酯萃取物中的揮發性成分。添加NaCl所得自溶物的乙酸乙酯萃取物共分離出49種成分，鑒定出28種，占總量的 92.14%，其中酯類3種，酸類5種，醇類4種，雜環類6種（吡咯、呋喃、吡咯并吡嗪、嘧啶、吡唑等），酚類2種、飽和芳香烴3種、飽和脂肪烴5種；添加木瓜蛋白酶所得自溶物的乙酸乙酯萃取物中共分離出49種成分，鑒定出27種，占總量的91.006%，其中酯類2種，酸類4種，醇類4種，雜環類7種（吡咯、呋喃、吡咯并吡嗪、嘧啶、噻唑、吡喃等），酚類5種，飽和芳香烴2種，不飽和芳香烴2種，以及腈類1種。

表1 不同促溶劑所得乙酸乙酯萃取物GC-MS成分分析

不同處理方式所得酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物共有21種成分，二者含量大于1%的共有化合物有：異辛酯鄰苯二甲酸、二異辛酯鄰苯二酸、4-羥基-4-甲基-2-戊酮、3-甲基-丁酸、甘油、2，4-二芐基-5，8-二甲氧基-6-甲基-1-萘酚、2，4-雙（1，1-二甲基乙基）-苯酚、苯乙醇、棕櫚酸、4-羥基-苯乙醇、甲基丙二酸二乙酯等11種。

以NaCl為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物較木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物多出：十八烷、二十烷、二十四烷、二十六烷等飽和烴，1，3-二甲基苯和甲基丙二酸二乙酯6種物質。以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物較以NaCl為促溶劑的酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物多出：苯甲酸、4-甲基-5-噻唑、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3-（4-羥基苯基）丙腈、3-（2-乙氧基）-苯酚、3，4，5-三甲氧基-苯酚等 6種物質。

將兩個總離子流圖中Y軸均置于2000000，可粗略比較兩種酵母細胞自溶物乙酸乙酯萃取物的成分含量。兩組中以NaCl為促溶劑組含量較高的有：4-羥基-苯乙醇、1-甲基-3-丙基-1H-吡唑-5-羧酸 （4-（甲硫基） 苯甲酸）、2-（苯基乙炔基）-吡啶、3-（2-乙氧基）-苯酚、吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮、六氫-3-（2-甲基丙基）等；以木瓜蛋白酶為促溶劑組含量較高的有：2，4-雙 （1，1-二甲基乙基）-苯酚、棕櫚酸、十八烷酸等。

以木瓜蛋白酶為促溶劑所得酵母細胞自溶物香味較濃且為肉香味，以NaCl為促溶劑所得酵母細胞自溶物組香味較淡，氣味清香。這可能是由于兩者具有的揮發性物質種類及含量有所差異造成的（Peter，2000）。

目前多以GC-MS研究酵母發酵酒精飲品（白酒、啤酒、紅酒）等的香味成分以改善酒類產品的口味，研究酵母抽提物的揮發性成分以生產不同味道的酵母味素（沈國惠等，1991）。產酒精發酵結束后，酵母菌培養基中揮發性代謝物多為短鏈脂肪酸醇酯等，包括乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯等及醇類中的苯乙醇等香味物質（陶興無，2004）。酵母抽提物多采用SPME-GCMS進行香味成分分析。本研究利用乙酸乙酯萃取酵母細胞自溶物與文獻報道SPME-GCMS所得成分差異較大（李祥等，2001），與其相比含有較多大分子物質以及芳香烴等。由于生產工藝、原料來源、產品批次的不同會得到不同的結果，但此結果也可能是由于萃取方法不同所導致。

[1]李祥，彭莉，王毅，等.酵母抽提物輻照揮發性成分分析[J].中國釀造，2001，115（5）：17 ～ 19.

[2]沈國惠，劉楊氓，施翔，等.啤酒酵母自溶條件的優化及其抽提物的揮發性風味成份[J].食品與發酵工業，1991，3：8 ～ 17.

[3]陶興無.酵母抽提物香氣活性化合物的分離與鑒定 [J].中國釀造，2004，141（12）：13 ～ 16.

[4]Peter.酵母萃取物中揮發性含硫香味成分的研究[J].農業知識，2000，16：51～62.

[5]Thompson J，Robbins E，Baker L.The Nonhomogeneity of Soybean-“Gamma-Sitosterol”[J].Sterols，1997，62（5），505 ～ 512.