植酸酶對(duì)黃金鯽鈣磷代謝的影響

李 萌，王桂芹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

植酸酶是催化植酸及其鹽類(lèi)水解為肌醇與磷酸鹽的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，屬磷酸單酯水解酶。植酸酶具有特殊的空間結(jié)構(gòu)，能夠分離植酸分子中的磷，將植酸鹽降解為肌醇和無(wú)機(jī)磷，同時(shí)釋放出與植酸鹽結(jié)合的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（施安輝等，2005）。植酸酶可以促進(jìn)植酸鹽的水解，磷酸根可以被魚(yú)類(lèi)吸收利用，對(duì)促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)具有較好的效果（陳立僑等，1994）。因此，在飼料中添加植酸酶，即降低了飼料成本，又減輕了養(yǎng)殖水體的負(fù)擔(dān) （文華等，2008）。本試驗(yàn)在全植物蛋白源的黃金鯽飼料中添加植酸酶研究對(duì)其鈣磷代謝的影響，以期為植酸酶在以植物蛋白源為主的魚(yú)飼料中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)用黃金鯽幼魚(yú)，購(gòu)自二八一四漁場(chǎng)。試驗(yàn)用植酸酶，購(gòu)自上海生物工程有限公司（酶活力為5000 U/kg）。試驗(yàn)共6組，對(duì)照組添加磷酸二氫鈣，試驗(yàn)1～5組分別添加植酸酶0、300、600、900、1200 U/kg。

植酸酶以次粉為載體進(jìn)行稀釋 （Jackson等，1996）。采用105℃恒溫烘干法測(cè)定水分；采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)；采用550℃灼燒法測(cè)定粗灰分；采用索氏抽提法測(cè)定粗脂肪；彈式熱量計(jì)測(cè)定能量；采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法測(cè)定鈣；采用鉬黃分光光度法測(cè)定總磷。飼料有效磷的含量用飼料中總磷、植酸磷含量和植酸酶活性計(jì)算參考方熱軍等（2006）中的方法。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)魚(yú)先暫養(yǎng)15 d，期間投喂相同基礎(chǔ)飼料，待試驗(yàn)魚(yú)適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后開(kāi)始正式試驗(yàn)。試驗(yàn)共6組，每組3個(gè)重復(fù)，分別飼養(yǎng)在240 L水族箱中，每個(gè)水族箱放養(yǎng)30尾初始體重為（10.71 ±0.16）g的黃金鯽幼魚(yú)。 每天 8∶00、16∶00投喂兩次，24 h充氣，試驗(yàn)飼養(yǎng)時(shí)間60 d，期間水溫為20～24℃，溶解氧＞6 mg/L。

1.2.2 樣品的采集 60 d飼養(yǎng)結(jié)束后，停食1 d，從每個(gè)水族箱中隨機(jī)取10尾魚(yú)，測(cè)定其體重、體長(zhǎng)等，取血漿，然后在冰盤(pán)上解剖，取肝胰臟、前腸（第一個(gè)會(huì)折處以前為前腸）和背白肌等，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 消化性能指標(biāo) 蛋白酶活力的測(cè)定：將存放于-20℃冰箱中的肝胰臟和腸組織樣品解凍、剪碎，按1 g組織加入9 mL生理鹽水的比例在玻璃勻漿器中勻漿，粗酶液于4℃、5000 r/min離心10 min，取上清液備用，用考馬斯亮蘭法測(cè)定組織勻漿中蛋白質(zhì)的含量，福林-酚法測(cè)定蛋白酶活力，以蛋白酶比活力表示。

蛋白酶活性定義為在30℃、pH 7.0的條件下，1 g食糜組織中蛋白酶1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量定為一個(gè)酶活力單位（U）。

鈣磷表觀消化率的測(cè)定：待試驗(yàn)進(jìn)行到第7天后，從第8天開(kāi)始，分別在上午、下午投食含有0.5%Cr2O3的飼料，2 h后用虹吸法收糞便于篩網(wǎng)中，選擇新鮮、有完整包膜的糞便于清潔烘箱中，65℃干燥、粉碎后裝瓶備用，連續(xù)收集糞便10 d。

鈣的測(cè)定采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法；磷的測(cè)定采用鉬黃分光光度法。其計(jì)算公式為：

表觀消化率（ADC）=[1-（C1/C2）（N2/N1）]×100；

式中：C1為飼料中Cr2O3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C2為糞便中Cr2O3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，N1為飼料中某元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；N2為糞便中某元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 脊柱骨鈣、磷指標(biāo)的測(cè)定 將剔除內(nèi)臟及兩側(cè)肌肉的魚(yú)體微波煮熟5 min，去掉魚(yú)頭骨及肋骨，將脊椎骨剝離干凈，于65℃烘箱內(nèi)烘24 h，室內(nèi)放置24 h制備成風(fēng)干樣，分析魚(yú)體和椎骨主要成分。鈣、磷測(cè)定方法同1.3.1。

1.3.3 血液生化指標(biāo)的測(cè)定 血漿的制備：每組隨機(jī)取10尾魚(yú)于冰盤(pán)內(nèi)取血，迅速轉(zhuǎn)移至抗凝管中，與抗凝劑充分混合，放入離心機(jī)中3000 r/min離心5 min，取上清保存于-20℃冰箱中。

血漿鈣、磷、堿性磷酸酶活力的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，測(cè)定步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 氮、磷排泄的測(cè)定 試驗(yàn)第10天開(kāi)始，每天10∶00和18∶00兩次測(cè)定水中氨氮和磷酸鹽的含量，連續(xù)測(cè)量7 d。

水中氨氮和磷酸鹽的測(cè)定采用陸恒生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，測(cè)定步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

排泄率（U）=V×[（ρ2-ρ20）-（ρ1-ρ10）]/（t×m）；

式中：U 表示排泄率，mg/kg·h；V 為代謝缸中水的總體積，L；ρ1、ρ2為初始水樣與終末水樣的氨氮濃度，mg/L；ρ10、ρ20為初始與終末時(shí)空白對(duì)照缸中水樣氨氮濃度，mg/L；m為試驗(yàn)魚(yú)體質(zhì)量，kg；t為初始水樣與終末水樣間隔的時(shí)間，h。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s多重比較分析組間差異顯著性程度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 植酸酶對(duì)黃金鯽消化的影響 由表2可知，隨著各試驗(yàn)組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，腸道蛋白酶活力有升高的趨勢(shì)，在試驗(yàn)添加到900 U/kg時(shí)，腸道蛋白酶比活力較試驗(yàn)1組提高15.78%（P＜0.05）；且與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，腸道蛋白酶比活力不再顯著升高；肝胰臟蛋白酶比活力受飼料中植酸酶水平的影響不顯著。

表2 飼料植酸酶水平對(duì)黃金鯽蛋白酶比活力的影響

由表3可知，隨著各試驗(yàn)組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，鈣、磷表觀消化率也有升高的趨勢(shì)，當(dāng)植酸酶含量添加到900 U/kg時(shí)，鈣、磷表觀消化率較試驗(yàn)1組分別提高6.48%和14.17%（P＜0.05），且與對(duì)照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，鈣、磷表觀消化率不再顯著升高。

表3 飼料植酸酶水平對(duì)黃金鯽鈣、磷表觀消化率的影響

2.2 植酸酶對(duì)黃金鯽鈣、磷沉積，血液生化指標(biāo)和氮、磷排泄的影響 由表4可知，隨著各試驗(yàn)組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，骨鈣和骨磷有升高的趨勢(shì)，在試驗(yàn)添加到900 U/kg時(shí)，骨鈣和骨磷分別較試驗(yàn)1組提高13.23%和4.93%（P＜0.05），且與對(duì)照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，骨鈣和骨磷不再顯著升高。

表4 飼料植酸酶水平對(duì)黃金鯽脊椎骨鈣、磷的影響 %

由表5可知，隨著各試驗(yàn)組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，血鈣有升高的趨勢(shì)，在試驗(yàn)添加到600 U/kg時(shí)，血鈣較試驗(yàn)1組高61.61%（P＜0.05），且與對(duì)照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，血鈣不再顯著升高；隨著各試驗(yàn)組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，血磷有升高趨勢(shì)，在試驗(yàn)添加到900 U/kg時(shí)，血磷與對(duì)照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，血磷顯著升高；各試驗(yàn)組黃金鯽血中堿性磷酸酶差異不顯著。

表5 飼料植酸酶水平對(duì)黃金鯽血鈣、血磷和血中堿性磷酸酶的影響

由表6可知，隨著各試驗(yàn)組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，氨氮和磷酸鹽有降低的趨勢(shì)，在試驗(yàn)添加到900 U/kg時(shí)，氨氮和磷酸鹽分別較試驗(yàn) 1組降低 19.68%和 13.47%（P＜0.05），且與對(duì)照組差異不顯著（P ＞ 0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，氨氮和磷酸鹽不再顯著降低。

表6 飼料植酸酶水平對(duì)黃金鯽氮、磷排泄的影響 mg/kg·h

3 討論

3.1 植酸酶對(duì)黃金鯽消化的影響 水生動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化通常以化學(xué)消化為主，即需要酶的參與。腸道酶活力的高低也代表水生動(dòng)物消化能力的強(qiáng)弱，特別是在無(wú)胃魚(yú)中，腸道酶活力更是重要的評(píng)定指標(biāo)。腸道蛋白酶是魚(yú)類(lèi)消化酶中最重要的酶。胰腺是水生動(dòng)物重要的消化腺，主要分泌蛋白酶原，其發(fā)育狀況直接體現(xiàn)酶原分泌狀況。Biswas等（2007）在對(duì)紅鯛的研究表明，當(dāng)試驗(yàn)魚(yú)肝胰臟的重量和肝體比顯著增加時(shí)，試驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)狀況良好。Liebert和Portz（2005）在對(duì)尼羅羅非魚(yú)的試驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶是唯一一種能夠顯著影響試驗(yàn)魚(yú)特定生長(zhǎng)率以及飼料利用率的消化酶。本試驗(yàn)在黃金鯽飼料中添加900 U/kg植酸酶顯著提高了腸道蛋白酶活性。這與張璐等（2009）對(duì)大黃魚(yú)的胃和腸道蛋白酶活性變化的研究一致。這表明在黃金鯽飼料中添加900 U/kg時(shí)，能提高黃金鯽的消化能力。

植酸可與磷形成不可溶二價(jià)或多價(jià)陽(yáng)離子鹽，與銅、鈷、鋅、錳、鎂和鐵形成復(fù)合物，與蛋白質(zhì)和氨基酸絡(luò)合，從而使這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能被魚(yú)體利用。加入植酸酶可消除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高魚(yú)體對(duì)飼料中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率（姚瑞清等，2008）。本試驗(yàn)在黃金鯽飼料中添加600 U/kg植酸酶顯著提高了鈣、磷表觀消化率。這與程宗佳（2004）在虹鱒的豆粕型飼料中添加不同水平的植酸酶，顯著提高了虹鱒的表觀消化率的結(jié)論相一致。

3.2 植酸酶對(duì)黃金鯽鈣磷代謝、排泄和沉積的影響 測(cè)量植酸酶對(duì)血漿中礦物質(zhì)元素含量的影響是衡量植酸酶改善魚(yú)類(lèi)礦物質(zhì)元素吸收利用率最可靠、最敏感的方法之一。低血鈣可以引起魚(yú)體骨鈣的迅速釋放，然而低血磷就不易使魚(yú)體中的骨磷釋放出來(lái)。因此，對(duì)魚(yú)類(lèi)來(lái)講低血磷就意味著缺磷，會(huì)引起骨營(yíng)養(yǎng)不良，表現(xiàn)為骨灰分占骨總重量的百分比下降。本試驗(yàn)在黃金鯽飼料中添加600 U/kg（鈣磷比為1∶1）植酸酶顯著提高了黃金鯽血鈣含量，但血磷含量變化差異不顯著。試驗(yàn)證明飼料中添加植酸酶對(duì)試驗(yàn)魚(yú)血漿中鈣、磷含量有影響，但差異不顯著。血漿堿性磷酸酶（AKP）的活性受血磷濃度影響。血磷濃度降低時(shí)，破骨細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)，使骨鹽降解并釋放入血，同時(shí)也使腎臟對(duì)磷的重吸收增強(qiáng)，致使魚(yú)體血液中游離的鈣和磷濃度均提高。而血鈣升高則引起降鈣素分泌，使成骨細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)，AKP釋放量增加，破壞骨組織附近Ca2+和PO43－的過(guò)飽和狀態(tài)，使之沉積。因此，血漿AKP活性升高，說(shuō)明動(dòng)物處于缺磷狀態(tài)。本試驗(yàn)在黃金鯽飼料中添加植酸酶并未顯著影響黃金鯽血中堿性磷酸酶的含量，但隨著植酸酶的添加量升高，血漿AKP的數(shù)值略有下降，表明黃金鯽飼料中添加植酸酶可緩解魚(yú)體缺磷的狀態(tài)。Sugiura等（1999）用不同含磷量的飼料飼養(yǎng)虹鱒的試驗(yàn)結(jié)果也表明，不管是在血漿中還是在腸道中，堿性磷酸酶活性與飼料含磷量多少無(wú)關(guān)，這與本試驗(yàn)研究的結(jié)果基本一致。

氮和磷是造成養(yǎng)殖水體的重要污染物之一。氨氮（NH3-N）和磷酸鹽（PO43-）是魚(yú)類(lèi)排泄磷的主要形式，因此氨氮和磷酸鹽的排泄也就常作為對(duì)魚(yú)類(lèi)排泄評(píng)價(jià)的指標(biāo)。本試驗(yàn)在黃金鯽飼料中添加900 U/kg植酸酶顯著提高了黃金鯽脊椎骨鈣、磷含量。主要由于植酸酶降解飼料中植酸時(shí)，降低植酸與飼料中蛋白質(zhì)的絡(luò)合作用，同時(shí)提高魚(yú)體內(nèi)源性蛋白酶的活性，使蛋白質(zhì)的消化吸收率提高，從而降低氮的排泄率（劉曉俠，2009）。這一結(jié)論與楊雨虹等（2009）對(duì)金鱒的研究結(jié)果一致。但周秋白（2001）在對(duì)大黃魚(yú)和鱸魚(yú)飼料中添加植酸酶的研究得知，植酸酶可以降低試驗(yàn)魚(yú)磷的排泄率，其主要原因可能是魚(yú)體所吸收的磷已超過(guò)其需求量，隨飼料中磷的不斷增加，磷的排泄率也就會(huì)有所增加。

脊椎骨鈣、磷沉積的測(cè)定是評(píng)價(jià)植酸酶改善魚(yú)體礦物質(zhì)元素吸收利用的重要指標(biāo)之一。楊雨虹等（2009）采用噴涂法將植酸酶添加到飼料中，顯著提高金鱒的椎骨鈣、磷含量同時(shí)也促進(jìn)肌肉中鈣、磷的沉積。Jackson等（1996）發(fā)現(xiàn)，在斑點(diǎn)叉尾鮰飼料中添加植酸酶能夠提高磷在試驗(yàn)魚(yú)骨骼中的沉積，同時(shí)排泄物中磷的含量隨植酸酶的添加而減少。本試驗(yàn)在黃金鯽飼料中添加900 U/kg植酸酶顯著提高了黃金鯽脊椎骨鈣含量。這與Fortes（2011）對(duì)歐洲鱸的試驗(yàn)結(jié)果一致。Nwanna等（2007）對(duì)鯉魚(yú)試驗(yàn)研究也表明，隨飼料中植酸酶添加量升高，脊椎骨鈣沉積量逐漸增加。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃金鯽全植物蛋白源飼料中添加適宜植酸酶可提高黃金鯽對(duì)磷的利用率，達(dá)到對(duì)照組（適宜的鈣磷比）鈣磷代謝的水平。在本試驗(yàn)條件下，植酸酶在黃金鯽全植物蛋白源飼料中的適宜添加量為600～900 U/kg。

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