刺五加多糖的提取工藝研究

陳芬芳， 于紅梅， 王 瑞， 褚秀玲， 蘇建青

（聊城大學農學院，山東聊城 252000）

刺五加為中國東北多年生落葉灌木，性溫、味辛、微苦、無毒，入脾腎經，具有祛風除濕、舒筋活血、益氣健脾、補腎安神之功效。現代藥理試驗研究證實，中草藥刺五加中含有皂苷、黃酮、多糖、微量元素和氨基酸等有效成分，具有增強機體抵抗力、抗疲勞和抗氧化等功效（王瑞強等，2013；田志浩等，2013）。刺五加多糖是從中草藥刺五加的根和莖中提取出的一種中草藥多糖 （龔婧如和王書芳，2012）。研究顯示，刺五加多糖具有增強免疫力、抗氧化和促進生長等功效。本試驗采用熱水浸提法從刺五加中抽提多糖，通過單因素試驗和正交試驗優化其提取工藝。

1 材料和方法

1.1 材料 刺五加飲片，購于聊城利民大藥房，60℃溫箱烘干后粉碎，過40目篩備用。葡萄糖、苯酚、濃硫酸，均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 刺五加多糖含量的測定 刺五加多糖的測定方法采用苯酚-硫酸法，按照姜瓊和謝妤（2013）的方法略有修改。

1.2.1.1 標準品溶液的配制 100 μg/mL的葡萄糖溶液：將葡萄糖置于105℃的干燥箱內烘干至恒重，精密稱取10.0 mg至100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解混勻，定容。

6%苯酚溶液：精密稱取6.0 g苯酚，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，混勻，裝入棕色瓶中，4℃避光保存。

1.2.1.2 葡萄糖標準曲線的繪制 吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的葡萄糖標準溶液，分別加入9支10 mL的具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，然后每個試管中分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，最后每個試管沿管壁迅速加入7.0 mL濃硫酸，搖勻，靜置10 min后放入80℃水浴中恒溫15 min，放置室溫冷卻。將第一個試管樣品作為空白對照，在波長490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸分析。

1.2.2 刺五加多糖提取的單因素試驗 刺五加多糖的提取采用熱水浸提法，每次稱取1.0 g刺五加粉末，加入燒瓶中，按料液比加入蒸餾水，浸泡30 min后，在水浴鍋中進行加熱。分別考察提取時間、提取溫度、料液比和提取次數4個因素對刺五加多糖提取率的影響。

1.2.2.1 提取時間對刺五加多糖提取率的影響提取時間分別選擇 1.0、1.5、2.0、2.5 h 和 3.0 h，料液比、提取溫度和提取次數分別固定為1∶25、80℃和2次。將2次的提取液合并，在波長490 nm處測定吸光度（A）值。根據1.2.1的標準曲線計算刺五加多糖的含量。

1.2.2.2 提取溫度對刺五加多糖提取率的影響提取溫度選擇50、60、70、80℃和90℃，料液比、提取時間和提取次數分別固定為1∶25（g/mL）、2 h和2次。將2次提取液合并，分別測定不同提取溫度下多糖的含量。

1.2.2.3 料液比對刺五加多糖提取率的影響 料液比選取 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 和 1∶35 （g/mL），提取溫度、提取時間和提取次數分別固定為80℃、2 h和2次。將2次提取液合并后，測定刺五加多糖的含量。

1.2.2.4 提取次數對刺五加多糖提取率的影響提取次數選擇1次、2次和3次，提取溫度、提取時間和料液比分別固定為 80 ℃、2 h 和 1∶25（g/mL）。提取后分別測定不同提取次數的提取液刺五加多糖的含量。

1.2.3 刺五加多糖提取的正交試驗 根據刺五加多糖提取的單因素試驗結果，以提取時間、提取溫度、料液比、提取次數為考察因素，設計四因素三水平正交試驗，優化提取條件，并采用SPSS 13軟件對正交試驗結果進行極差分析和方差分析。正交試驗因素與水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平

1.2.4 驗證性試驗 根據正交試驗獲得的最佳提取工藝條件對刺五加多糖進行提取，重復3次，分別計算多糖的提取量，考察該條件下提取刺五加多糖的提取率及變異系數，以確定試驗結果的可行性和準確性。

2 結果與分析

2.1 多糖測定方法的建立 以葡萄糖配制標準溶液，采用苯酚-硫酸法測定不同濃度的葡萄糖溶液在490 nm處的吸光值，繪制標準曲線。不同濃度的標準葡萄糖溶液與其對應吸光值的線性回歸直線如圖1所示，線性擬合方程為A=0.6653C-0.0025，R2=0.9975，試驗表明，葡萄糖溶液濃度在0.01～0.08 mg/mL與吸光度值呈良好的線性關系。

圖1 葡萄糖溶液標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對刺五加多糖提取率的影響 由圖2可知，在1.0～2.0 h，刺五加多糖的提取率隨提取時間的延長而增加，最高達到18.18 mg/g，但是超過2.0 h后，多糖的量逐漸減少。分析原因可能是刺五加多糖發生了水解，或隨著提取時間的延長，刺五加中的其他雜質成分亦被提取出來，干擾了刺五加多糖的溶解量。因此，選定2.0 h作為單因素試驗的最佳提取時間。

圖2 提取時間對刺五加多糖提取率的影響

2.2.2 提取溫度對刺五加多糖提取率的影響 由圖3可知，當提取溫度超過60℃以后，刺五加多糖的提取率隨溫度的升高而增加，但是在70～90℃，多糖提取率的增幅趨于平緩，70、80、90℃的提取率分別是 16.93、17.05、18.02 mg/g。 考慮到高溫會引起多糖的變性分解，因此選擇80℃作為單因素試驗的最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對刺五加多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對刺五加多糖提取率的影響 由圖4 可知，料液比在 1∶15～1∶25（g/mL）時，刺五加多糖的提取率是逐漸增加的，1∶25（g/mL）時多糖的提取率達到了 16.87 mg/g， 但是超過 1∶25（g/mL）以后，多糖的提取率反而下降。因此，選擇最佳的料液比為 1∶25（g/mL）。

圖4 料液比對刺五加多糖提取率的影響

2.2.4 提取次數對刺五加多糖提取率的影響 通常隨著提取次數的增加，多糖的提取率逐漸升高。由圖5可知，提取1次、2次和3次，多糖的提取量分別是12.59、19.77、22.36 mg/g。所以，選擇3次作為最適提取次數。

圖5 提取次數對刺五加多糖提取率的影響

2.3 正交試驗結果 正交試驗與方差分析結果見表2和表3。通過極差分析顯示提取溫度的R值最大，為4.941，其次是提取次數。根據R值的大小判定，4個因素對提取率的影響順序為提取溫度＞提取次數＞料液比＞提取時間。通過方差分析可知，F（A）＜ 0.05，F（B）＜ 0.05，即提取次數和提取溫度對刺五加多糖的提取率影響顯著。因此，最佳提取方案確定為A3B3C2D3，即提取次數為3次，提取溫度為 90 ℃，料液比為 1∶25（g/mL），提取時間為 2.5 h。

2.4 驗證性試驗結果 在提取溫度90℃、料液比為 1∶25（g/mL）、提取時間 2.5 h、提取次數 3 次時，刺五加多糖的提取率為23.95 mg/g，RSD為1.98%（n=3），明顯高于市場平均水平，故該條件即為刺五加多糖的最佳提取工藝。

3 討論與結論

刺五加是長白山地區大宗地道中藥材，其藥用價值高，需求量較大。傳統的飲片利用浪費較大，對刺五加原藥材有效成分的提取和研究，可提高藥材利用效率。刺五加多糖具有免疫增強和抗疲勞、抗氧化作用，是理想的免疫增強劑（劉樹民和張娜，2014）。如能對刺五加及其有效成分——刺五加多糖進一步提取和純化，提高其純度，將對刺五加制劑的研究及臨床療效產生巨大的影響。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析結果

由于影響刺五加多糖提取的主要因素有料液比、提取溫度、提取時間、提取次數和炮制方法等（孟凡欣等，2005）。本試驗重點考察了料液比、提取溫度、提取時間和提取次數對刺五加多糖提取率的影響，并利用正交試驗優化了刺五加多糖的提取工藝條件，在最佳提取工藝條件下獲得的多糖含量達到23.95 mg/g。

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