環介導等溫擴增技術的假陽性擴增研究

王德國，王永真，王愛萍

(1．許昌學院食品與生物工程學院，河南省博士后研發基地，河南許昌461000;2．許昌學院公共實驗中心，河南 許昌461000;3．鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州450000)

日本學者Notomi等2000年發明報道了環介導等溫擴增技術［1］，據谷歌統計截至目前該報道已被引用2146次，該技術通過多對引物巧妙實現擴增，環介導等溫擴增反應效率非常高，因為無溫度變化的耗時，后來環引物的提出進一步縮短了反應時間［2］，因此環介導等溫擴增在反應速度、特異性、靈敏度方面優于鏈式聚合酶反應(PCR)［3，4］、酸序列依賴性擴增(NASBA)［5，6］、鏈替代擴增反應(SDA)［7］、滾換擴增反應(RCA)［8］和解鏈酶擴增(HAD)［9］，然而，在科技成果快速轉化的當今時代，環介導等溫擴增技術經過十多年的研究開發，仍然沒有實際應用，主要由于這種核酸擴增檢測方法假陽性率高，本研究旨在研究分析引起假陽性擴增的主要原因，為環介導等溫擴增技術的實際應用提供理論與實踐基礎．

按照Notomi等2000年所報道的試驗設計引物，以相同的反應體系與擴增條件開展實驗，而本實驗結果與所報道的完全不同．

1 實驗材料與方法

1．1 引物

采用Notomi等報道中針對M13的環介導等溫擴增引物，由生物工程(上海)有限公司合成，如表1所示．

表1 環介導等溫擴增引物

1．2 DNA 模板

實驗室沒有M13DNA模板，因此，在本研究中也就不存在模板引起的氣溶膠污染及交叉污染問題．

1．3 環介導等溫擴增反應

按照Notomi等報道的反應體系與反應條件進行擴增反應，只是所有的反應管中均不加DNA模板，加入不同引物組合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP;F3+B3)各種引物的濃度與Notomi等報道的相同，擴增后2%的瓊脂糖凝膠電泳，重復三次．

2 結果與分析

如圖1所示，其中四種引物組合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP)均能非特異擴增，并且具有典型的LAMP梯度條帶，而Notomi等報道的試驗中陰性對照沒有擴增，并且沒有典型的LAMP梯度條帶［1］．

目前該領域的科研工作者普遍認為環介導等溫擴增技術靈敏度高，容易產生氣溶膠污染，交叉污染是導致假陽性率高的主要原因，在實現不開蓋檢測方面做了大量研究與嘗試，如濁度法檢測［10］、實時濁度法檢測［11］、熒光染料檢測［12-14］、免疫側向層析試紙檢測［15］、使用指示劑羥基萘酚藍檢測［16，17］以及日本榮研公司的鈣黃綠素檢測，擴增產物的檢測手段近乎非常完美，但不開蓋檢測并沒有把環介導等溫擴增推向實際應用，正如本研究結果所表明的，引起環介導等溫擴增假陽性的主要原因不是氣溶膠污染，而是引物的非特異性擴增．環介導等溫擴增通過多對引物實現巧妙擴增，使用多對引物難免會形成引物二聚體和出現非特異性擴增，特別是在環介導等溫擴增反應中引物、鎂離子、dNTP和酶的濃度比Real-time PCR中的高好幾倍，在Real-time PCR研究中，為了避免非特性擴增需要嚴格控制這四個因素的濃度．在本研究中，甚至一對內引物就可以非特異性擴增，因此，目前環介導等溫擴增技術只是理想的分子模型，在該技術的應用研究中應致力于解決非特異性擴增問題．

圖1 不加模板的情況下環介導等溫擴增結果

3 結論

環介導等溫擴增技術推廣應用的瓶頸是假陽性率高，導致假陽性率高的主要原因是引物二聚體引起的非特異性擴增，其次是氣溶膠污染．本研究的創新之處在于首次發現限制環介導等溫擴增技術推廣應用的真正原因所在．

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