納豆固體發酵條件的優化

王麗娜，李培睿

(許昌學院食品與生物工程學院，河南許昌461000)

納豆是日本的一種傳統發酵食品，是由蒸煮后的大豆接種納豆芽孢桿菌后發酵而制成的一種大豆發酵食品［1-2］，迄今為止已有2000多年的歷史［3］．納豆芽孢桿菌是納豆生產中最重要的因素和有效成分．經納豆芽孢桿菌發酵后的納豆不但含有大豆的全部營養，而且產生多種酶和維生素、并可在納豆周圍產生多聚谷氨酸和多聚果糖的混合型粘性物質等多種生物活性物質［4］．其中含有的納豆激酶具有很好的溶栓作用［5］，在預防高血壓、動脈粥樣硬化方面具有很好的作用．正是由于納豆的營養豐富，并且具有抗血栓、降血壓、抗腫瘤、抗菌、預防骨質疏松等神奇的功效［6-7］，使其成為保健食品開發的熱點之一，具有非常廣闊的發展前景．但是由于納豆在發酵過程中產生的氨味很難讓中國消費者接受，所以目前市場上銷售的納豆產品很少，僅在個別大型超市里有所銷售．為了解決納豆口味的問題，本課題對發酵工藝進行了優化，旨在生產出適合中國人口、營養價值極高、價格低廉的納豆產品．

1 材料與儀器

1．1 材料

酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、0．5%NaCI、1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl、36%甲醛溶液、0．05 mol/L NaOH標準溶液、市售大豆、納豆芽孢桿菌．

1．2 儀器

HZP-250型全溫震蕩培養箱(上海福瑪實驗設備有限公司);YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司);超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司);JA3003J(電子天平，上海平軒科學儀器有限公司);722可見分光光度計(上海舜宇恒平);PHS-3CT精密pH計(上海精密儀器儀表有限公司);25 mL堿式滴定管等．

2 實驗方法

2．1 種子菌懸液的制備

首先挑取斜面種子接入裝有60 mL種子培養基［8］(3．0%葡萄糖+4．0%蛋白胨+0．5%NaCl+0．5%牛肉膏+0．5%酵母膏)的250 mL三角瓶中，然后在35℃、200 r/min下搖床培養，每隔兩小時測一次OD660 nm值，最終確定最佳的接種菌齡．

2．2 納豆制作流程［9］

大豆精選、清洗→浸泡→分裝→蒸煮→冷卻→接種→發酵→后熟→成品→感官評價和理化指標的測定

2．3 納豆的感官評價及理化指標的測定

2．3．1 納豆的感官評價

參與感官評定的人員為在校的學生和老師共計28人，首先對市售的納豆進行感官評定，然后對本實驗的納豆進行感官評定，評分標準見表1［10］．感官評定采用四個指標，因其氣味是中國居民最難以接受的，所以在分值上占的比重較大，感官評定后計算各項指標的平均值為本項得分．

表1 納豆感官評定評分標準

2．3．2 理化指標測定

2．3．2．1 氨基酸態氮測定方法

氨基酸態氮的測定方法參照GB/T 5009．39-2003．

2．3．2．2 粘多糖含量測定方法

納豆中的粘液是由粘多糖組成的，所以測定納豆的粘液率即為納豆中粘多糖的含量［11］．取5．00 g納豆一式兩份，一份直接在105℃烘箱至恒重．另一份用溫水輕輕洗掉納豆表面的粘液，再將納豆移入烘箱中烘至恒重，所得數據即為粘多糖產率，重復三次求平均值［12］．

2．4 單因素試驗

2．4．1 最佳浸泡時間的確定

將挑選好的黃豆清水洗過后，用3倍的溫水(17～20℃)分別浸泡10 h、14 h、18 h、22 h、26 h，瀝干，于121℃滅菌20 min，接種10%由2．3確定的種子液，濕度85% ～90%，35℃培養24 h，后熟20 h后分別進行感官品評及理化指標的測定．

2．4．2 最佳蒸煮時間的確定［13］

將挑選后的黃豆先用清水清洗，然后用3倍溫水浸泡，瀝干，于121℃時分別蒸煮20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，接種10%種子液，在35℃時培養24 h，后熟20 h后分別進行感官品評及理化指標的測定．

2．4．3 最佳接種量的確定

先將大豆清洗浸泡后，按照2．3．2所確定的最佳蒸煮時間進行蒸煮，冷卻后分別接種5%、10%、15%和20%的種子液，在35℃培養24 h，后熟后分別進行感官品評及理化指標的測定

2．4．4 最佳發酵溫度的確定

按照上述最優條件進行浸泡、蒸煮、冷卻、接種種子液后，分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的培養箱中發酵24 h，后熟后進行感官品評及理化指標的測定．

2．4．5 最佳發酵時間的確定

按照上述最優條件進行浸泡、蒸煮、冷卻、接種種子液后，放入到由2．5．4確定的最佳發酵溫度的培養相中進行培養，分別發酵18 h、24 h、30 h小時后進行感官評定和理化指標的測定．

2．4．6 最佳后熟時間的確定

按照上述的最佳條件制備納豆，發酵完成后，再放入5℃冰箱中進行后熟，分別后熟18 h、24 h、30 h、36 h，最后進行感官品評及理化指標的測定，以確定最佳后熟時間．

2．5 正交試驗

以單因素試驗為基礎，對影響納豆感官評定較明顯的接種量、發酵溫度、發酵時間三因素做三因素三水平試驗，進一步確定納豆的最佳發酵條件．

3 實驗結果

3．1 最佳種子發酵液的確定

根據2．2的方法進行實驗，試驗結果如圖1所示，從圖中可以看出，從6～18 h為對數生長期，在接種培養時應選擇生長力旺盛的對數期作為種子液，綜合考慮后選擇培養16 h的發酵液為種子培養液．

3．2 單因素試驗結果

3．2．1 最佳浸泡時間及蒸煮時間及接種量的確定

按 2．5．1、2．5．2、2．5．3 的方法進行試驗，試驗結果如圖2、表2、表3、表4所示，從結果可以看出，浸泡時間為22 h、蒸煮40 min、接種量為15%時納豆的感官評分最高，理化指標值也為最高，所以確定大豆的最佳浸泡時間為22 h，最佳蒸煮條件為121℃、40 min，最佳種子液的接種量為15%．

圖1 納豆芽孢桿菌生長曲線

圖2 浸泡時間、蒸煮時間及接種量對納豆感官評價的影響

表2 浸泡時間對納豆理化指標的影響

表3 蒸煮時間對納豆理化指標的影響

表4 接種量對納豆理化指標的影響

3．2．2 最佳發酵溫度、發酵時間及后熟時間的確定

按照 2．5．4、2．5．5、2．5．6 的方法進行試驗，試驗結果如圖 3 及表 5、表 6、表 7 所示．從各圖及表中可以看出在發酵溫度為35℃、發酵時間為24 h、后熟時間為24 h時，納豆的感官評價和理化指標達到高值，所以可以初步確定納豆的最佳反應條件如下，發酵溫度為35℃、發酵時間為24 h、后熟時間為24 h．

3．3 正交試驗結果

按照2．6的方法進行正交試驗，試驗結果如表8所示．對試驗結果做極差分析，可以看出接種量對納豆的感官評分影響最大，其次為接種量和發酵時間．最終確定的最優配比為A2B3C2．即接種量為15%、發酵溫度為37℃、發酵24 h時納豆的感官評分最高，在正交試驗表中為92分，所以確定以上的條件為納豆發酵的最佳條件．

圖3 發酵溫度、發酵時間及后熟時間對納豆感官評價的影響

表5 發酵溫度對納豆理化指標的影響

表6 發酵時間對納豆理化指標的影響

表7 后熟時間對納豆理化指標的影響

表8 納豆最佳發酵條件正交表及結果分析

4 結語

精選大豆洗凈后先用3倍溫水(17～20℃)浸泡22 h，再于121℃蒸煮40 min，晾涼后接種15%培養16 h的種子發酵液，搖勻后放于37℃恒溫培養箱中，培養24 h進行發酵．發酵完成后，放入5℃冰箱后熟24 h，此時納豆的感官性狀最佳，理化指標達到較優值．用這種方法制作出的納豆不但口感好而且具有極高的營養價值和保健功能，為納豆的家庭制作和工業化生產提供了基礎．

［1］ 史延茂，田智斌，張聰莎，等．傳統發酵大豆制品功能成分的研究進展［J］．中國調味品，2012，37(12):13-20．

［2］ 祖國仁，孔繁東，劉 陽，等．納豆固體發酵條件及產品成分分析［J］．食品工業科技，2006，27(12):122-124．

［3］ 孫 婕，劉 寧．納豆的保健功效［J］．中國調味品，2007(7):13-20．

［4］ 趙 欣，冉龍江，邵林楠．水豆豉和納豆的理化特性及抗突變效果的比較［J］．廊坊教育學院學報，2008，15(2):49-50．

［5］ 蒲金嶺．納豆激酶高產菌株的篩選及發酵條件的優化［J］．大豆通報，2004(2):22-23．

［6］ 陳麗娟，沙常青，奚新偉，等．納豆激酶溶解血栓機制［J］．中國生物工程雜志，2003，23(4):53-56．

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［11］劉 晶，李紅玲，王 妍，等．微生物發酵法生產納豆工藝條件的優化研究［J］．東北農業大學學報，2011，42(8):25-29．

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