哺乳動物雷帕霉素靶蛋白結構與信號通路研究進展

李 欣

(成都大學體育學院，四川 成都610600)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可以感受細胞所處環境的營養狀態和能量狀態，是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞營養狀態、能量狀態的傳感器，它處于PI3K/Akt信號通路的下游，能感受并整合經PI3K信號通路傳遞的生長因子信號，在調節細胞生長和細胞周期中起非常關鍵的作用［1］．目前的研究表明，其調節作用主要集中在以下幾個方面:(1)通過影響p70S6K的活性而調控核糖體的生成;(2)通過改變4E-BP1的磷酸化狀態而調控翻譯起始復合物的功能;(3)通過影響真核延伸因子-2激酶，而調控多肽鏈的延伸［2］．

1 結構

在釀酒酵母中發現兩種可被雷帕霉素抑制的基因:TOR1和TOR2，其編碼的雷帕霉素靶蛋白是一種高度保守的大分子蛋白，可以抵抗免疫親和蛋白-免疫抑制劑復合物(FKBP-雷帕霉素)的生長抑制效應．TOR1和TOR2基因編碼兩種分子量為280道爾頓，相似度70%的TOR1和TOR2蛋白，其哺乳動物直向同源物為mTOR，mTOR蛋白與酵母TOR相比，其氨基酸序列有42%的相似，蛋白包括2 549個氨基酸和幾個保守的結構功能域．N端包括20個連續的由37-47個氨基酸殘基組成的HEAT重復序列，分為兩簇，構成一對反向平行α-螺旋結構，調節復合蛋白質中蛋白與蛋白間的親和力［3］．

TOR蛋白在C端有一個與PI3K和肌醇磷脂4位激酶高度同源的催化功能域，其相關蛋白家族成員包括:MEC1、TEL1、RAD3、MEI-41、DNA-PK、ATM、ATR和TRRAP．．這些蛋白的C端都有一個同源的磷脂酰肌醇激酶功能域，因此被稱為PI3K-相關激酶蛋白家族．但mTOR從功能上看是還是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它還包括一個FKBP-雷帕霉素結合功能域(FRB)，該功能域可以出現氨基酸替換，阻止FKBP-雷帕霉素復合物與mTOR的結合，在FRB和催化功能域間存在一個約為500氨基酸序列的FAT功能域，起到支架或蛋白-蛋白作用功能域的作用．在C端還含有一個大約35個氨基酸的延伸序列:FATC功能域，該功能域為mTOR活性所必需，去除任意一個該功能域的氨基酸都會使mTOR活性喪失［4］，FATC和FAT相互作用可產生催化功能，在兩個功能域間，可能還存在一個陰性調節功能域NRD．其具體結構見圖1［3］．

在哺乳動物體內，mTOR一般以兩個功能不同的復合物形式存在:mTORC1和mTORC2［5］．mTORC1時，mTOR與兩個高度保守的蛋白質Raptor和G蛋白β亞基樣蛋白結合，Raptor是種進化保守的分子量為150道爾頓，其與mTOR的HEAT功能域，以及p70S6K和4E-BP1上的TOR信號模序結合．Raptor可通過穩定mTOR的正確折疊，或作為支架蛋白將底物募集到激酶功能域附近，或通過調節mTOR的細胞內定位來介導mTOR對營養物質的感受［6］．Raptor和mTOR之間的相互作用需要G蛋白β亞基樣蛋白(G protein β-subunit-like protein，GβL)，其是另一種mTOR的結合蛋白，分子量為36道爾頓，含有7個WD-40重復序列，可直接結合到mTOR的催化功能域，參與mTOR對氨基酸水平的感受．mTORC2時，mTOR與Rictor、mSIN1和GβL形成復合物．mTORC2最有特性的功能是可以磷酸化Akt的絲氨酸殘基473，而該殘基正是Akt磷酸化mTORC1的位點，且Akt的轉角基序蘇氨酸殘基450也需要mTORC2的磷酸化，因此，在Akt信號通路中，mTORC2位于Akt的上游，而mTORC1則位于Akt的下游［7］．

圖1 mTOR結構示意圖

2 mTOR的上游調節因子

2．1 營養物質對mTOR的調節

當TOR1和TOR2蛋白從出芽酵母中提取出來時，也發現了與它們結合的蛋白質:AVO1、AVO2、AVO3、LST8和KOG1．AVO1、AVO2、AVO3只和TOR2結合，而LST8和KOG1則可與TOR1或TOR2任意單獨的結合．其結合不受雷帕霉素或營養剝奪的影響．但當mTOR-Raptor結合后，營養環境對mTOR與底物結合并磷酸化的能力有顯著影響，在存在雷帕霉素或營養剝奪時，mTOR基因的細胞周期停留在G0期，mTOR-GβL-Raptor與底物的結合能力喪失;而當營養充裕時，Raptor與mTOR的底物間的親和力增加．值得注意的是，雷帕霉素可以導致Raptor與mTOR間的解離，而營養剝奪則不會．

細胞內的氨基酸水平也可以調節mTOR的活性，其中亮氨酸的作用最為顯著［8］．亮氨酸濃度的增高可以通過Rheb和AMKP，而不是生長因子信號通路來增加mTOR的活性，但其控制mTOR活性的具體機制尚不明了，現有證明表明這可能與線粒體代謝變化相關［9］．mTOR也可通過調節氨基酸透酶的活性來調節細胞內的氨基酸濃度．ATP濃度下降或線粒體功能失調會激活AMKP，從而抑制mTOR表達［10］．在缺氧或低血糖時，細胞內升高的腺苷單磷酸活化蛋白通過變構作用激活AMKP，磷酸化其下游靶因子，抑制mTOR，降低ATP的消耗．AMPK也可磷酸化mTOR的負調控因子TSC2，而減弱mTOR表達．

2．2 PI3K

mTOR的活性可被生長因子調節，胰島素和其他生長因子可顯著增加mTOR敏感型的S6K和4EBP1的磷酸化程度．PI3K的激活可以使4E-BP1因胰島素引起的磷酸化程度達到最大，當使用PI3K抑制劑渥曼青霉素和LY294002時，S6K和4EBP1的磷酸化程度降低，這些證據表明生長因子引起的mTOR的激活須經PI3K介導，即PI3K是mTOR上游的正性調節因子［11］．在HEK-293細胞株中，過表達的PI3K催化亞基-p110可以在缺乏生長因子或胰島素時，導致4EBP1的磷酸化，負性調節亞基P85的過表達能抑制胰島素誘導的S6K的磷酸化．這些結果與PTEN缺乏后細胞中4E-BP1和p70S6K高水平磷酸化的變化是一致的．

2．3 Akt

絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶Akt是PI3K的下游效應物，在調節mTOR活性中具有重要作用．哺乳動物細胞表達三種由不同基因編碼的Akt蛋白．Akt激活的限速步驟包括PH功能域與PI3K結合-異位至細胞膜-被PDK1磷酸化．HEK-293細胞株中過表達的完全激活形式的Akt可以在缺乏生長因子和存在渥曼青霉素時，提高4E-BP1的磷酸化程度．而具有顯性負效應的Akt可以損壞胰島素誘導的4E-BP1的磷酸化．這些表明Akt是mTOR的上游調控因子［12］．當缺乏Akt1和Akt2時，p70S6K的磷酸化下降程度少于4E-BP1，提示p70S6K的磷酸化主要依賴于Akt3，而4E-BP1的磷酸化更依賴于Akt3．但一些實驗對Akt作為mTOR上游正性調節因子的地位表示了懷疑:在哺乳動物細胞中p70S6K的磷酸化與Akt的活性并不總是保持一致;Akt作用于mTOR的機制仍不明了，mTOR擁有兩個臨近的磷酸化位點，蘇氨酸殘基2446和絲氨酸殘基2448，Akt可磷酸化絲氨酸殘基2448，而這兩個殘基均位于mTOR的負性調節功能域中，且這兩個氨基酸被丙氨酸替換后對mTOR的活性沒有影響．

2．4 TSC1/TSC2

結節性硬化癥的的錯構瘤蛋白和結節蛋白是由結節性硬化癥中腫瘤抑制突變基因TSC1和TSC2編碼的，這兩種蛋白質通過N端連接，組成一個異二聚體復合物，形成一個抑制mTORC1活性的功能單位，是mTOR的上游負調控因子．該二聚體缺乏時，p70S6K和4E-BP1的磷酸化程度均增高，可產生與PTEN突變相似的細胞和器官體積增大的效果，而該二聚體過表達時，p70S6K和4E-BP1的磷酸化程度均降低．TSC2含有一個GTP酶激活蛋白(GAP)的功能域域，刺激小G蛋白Rheb內在的GTP酶活性，從而使Rheb轉化為GDP結合的滅活狀態．而當Rheb是GTP結合狀態時，它可激活mTORC1．在受到生長因子作用時，活化的Akt可以直接磷酸化TSC2的氨基酸殘基，而使其失去抑制Rheb作用的活性來激活mTOR．但過表達的TSC2發生α替代變異時，可阻斷Akt介導的mTORC1的激活．這些表明Akt介導的TSC2的磷酸化對調節mTORC1活性十分重要［13］．Rheb是TSC2GTP酶的一個直接底物．營養豐富時，Rheb處于活化狀態，與GTP結合，并與包括mTOR在內的多種蛋白發生作用．而營養缺乏時，TSC2的GTP酶激活蛋白域誘導Rheb水解失活形成Rheb-GDP，從而抑制mTOR活性．總之，Rheb是位于TSC1/TSC2復合物下游，mTOR的正調控因子．同時，TSC2是細胞內AMP/ATP比例感受器AMPK的直接底物，ATP水平下降時，磷酸化狀態的AMPK能磷酸化并激活TSC2，從而通過Rheb抑制mTOR信號［14］．

3 mTOR的下游效應物

mTOR受氨基酸或生長因子刺激時，可以經激活p70S6K和抑制4EBP-1來控制翻譯起始，p70S6K的激活可以導致核糖體蛋白S6的磷酸化，從而使5'TOP mRNAs翻譯，這種mRNA含有大量的轉錄產物，可以編碼大部分的核糖體蛋白和翻譯元件．因此，通過控制5'TOP mRNAs翻譯，mTOR上調了翻譯效率．4EBP-1是翻譯抑制物，可被mTOR磷酸化滅活，從而與eIF4E脫離，eIF4E可與帽結構結合，開始帽依賴性翻譯．

3．1 4E-BPs

eF4E和eIF4G的相互作用受4E-BPs調控，哺乳動物的4E-BPs是由3種不同的基因編碼而成的低分子量蛋白:4E-BP1、4EB-P2和4E-BP3．低磷酸化的4E-BPs與eIF4E有著高度的親和力，而高磷酸化的4E-BPs則不與eIF4E作用［15］．4E-BPs的磷酸化位點包括:蘇氨酸殘基37、蘇氨酸殘基46、絲氨酸殘基65、蘇氨酸殘基70、蘇氨酸殘基83、絲氨酸殘基101和絲氨酸殘基112．4E-BPs從eIF4E上脫落時，其殘基磷酸化按蘇氨酸殘基37、蘇氨酸殘基46、絲氨酸殘基65、蘇氨酸殘基70的順序進行．mTOR只磷酸化絲氨酸殘基65時，4E-BP1無法與eIF4E分離，但當用一個氨基酸去替代絲氨酸殘基65時，會大大減弱4E-BP1與eIF4E的結合，因此其余殘基的磷酸化協同會加快4E-BP1與eIF4E的解離．

3．2 p70S6K

哺乳動物細胞含有兩種由不同基因編碼的S6激酶，S6激酶調節細胞生長，是TOR蛋白的直接靶物質，S6激酶通過作用于其直接下游效應因子S6蛋白，增加mRNA的翻譯效率來控制細胞生長．S6蛋白的磷酸化與5‘TOP mRNA的翻譯效率相關，但目前的研究表明S6蛋白并不是調節5‘TOP mRNA翻譯的唯一因子．eIF4B也是S6K的靶物質，eIF4B對RNA解旋酶eIF4A具有調節作用，其絲氨酸殘基422是S6K的特異性磷酸化位點，因此eIF4B可能是S6K在翻譯和細胞生長中的重要調節因子，由于eIF4B能幫助eIF4A打開RNA的二級結構，所以eIF4B的磷酸化程度增強能提高具有二級結構的mRNA的翻譯效率．

3．3 eIF4G

eIF4G是一個支架蛋白，在組裝核糖體起始復合物中起著關鍵作用．eIF4G包括eIF4G1和eIF4G2，均包括三個通過鉸鏈區連接的功能和結構域．兩者都是磷蛋白，但他們的磷酸化調節方式不同，當受到血清、胰島素和生長因子的刺激時，eIF4G1的磷酸化程度高于eIF4G2，eIF4G1包括兩簇磷酸化位點，一個位于N端的絲氨酸殘基314，另一個在蛋白中間的鉸鏈區，包括絲氨酸殘基1148、1188和1232，對PI3K和mTOR抑制劑敏感．當eIF4G被mTOR磷酸化時，發生構象改變，活性增加［16］．

3．4 真核延伸因子-2激酶

mTOR對翻譯的調節中還存在其它靶蛋白:真核生物延伸因子-2激酶．真核延伸因子-2蘇氨酸殘基56的磷酸化可導致失活，雷帕霉素能通過對真核延伸因子-2激酶的影響來抑制真核延伸因子-2的去磷酸化．雷帕霉素磷酸化真核延伸因子-2激酶的位點為絲氨酸殘基78位，359和366［17］．

4 研究展望

mTOR不僅在細胞生長中控制mRNA翻譯，調控蛋白質合成，而且還參與刺激基因的轉錄過程．營養物質充足時，mTOR能通過將一些受營養調控的轉錄因子滯留在細胞質中，從而抑制這些饑餓特異性基因的轉錄．通過對轉錄因子STAT3一級結構的研究發現，其存在TOR識別基序(TOR signaling)，提示其可能被Raptor募集，而后被mTOR磷酸化．目前的研究已證實聚合酶I特異性轉錄因子上游結合因子UBF和轉錄起始因子1A也是受mTOR調節的靶物質．mTOR可以通過UBF來刺激rRNA的轉錄．

［1］ Foster KG，Fingar DC．Mammalian target of rapamycin(mTOR):conducting the cellular signaling symphony［J］．J Biol Chem，2010，285(19):14071-7．

［2］ Hay N，Sonenberg N．Upstream and downstream of mTOR［J］．Genes Dev，2004，18(16):1926-45．

［3］ Schmelzle T，Hall MN．TOR，a central controller of cell growth［J］．Cell，2000，103(2):253-62．

［4］ Takahashi T，Hara K，Inoue H，et al．Carboxyl-terminal region conserved among phosphoinositide-kinase-related kinases is indispensable for mTOR function in vivo and in vitro［J］．Genes Cells，2000，(9):765-75．

［5］ Huang J，Manning BD．A complex interplay between Akt，TSC2 and the two mTOR complexes［J］．Biochem Soc Trans，2009，37(Pt 1):217-22．

［6］ Kim DH，Sarbassov DD，Ali SM，et al．GbetaL，a positive regulator of the rapamycin-sensitive pathway required for the nutrient-sensitive interaction between raptor and mTOR ［J］．Mol Cell，2003，11(4):895-904

［7］ Wullschleger S，Loewith R，Hall MN．TOR signaling in growth and metabolism［J］．Cell，2006，124(3):471-84．

［8］ Kimball SR，Jefferson LS．Molecular mechanisms through which amino acids mediate signaling through the mammalian target of rapamycin ［J］．Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2004，7(1):39-44．

［9］ Xu G，Kwon G，Cruz WS，et al．Metabolic regulation by leucine of translation initiation through the mTOR-signaling pathway by pancreatic beta-cells［J］．Diabetes，2001，50(2):353-60．

［10］ Gleason CE，Lu D，Witters LA，et al．The role of AMPK and mTOR in nutrient sensing in pancreatic beta-cells［J］．J Biol Chem，2007，282(14):10341-51

［11］ Brunn GJ，Williams J，Sabers C，et al．Direct inhibition of the signaling functions of the mammalian target of rapamycin by the phosphoinositide 3-kinase inhibitors，wortmannin and LY294002 ［J］．EMBO J，1996 ，15(19):5256-67．

［12］ Kroczynska B，Kaur S，Platanias LC．Growth suppressive cytokines and the AKT/mTOR pathway［J］．Cytokine，2009，48(1-2):138-43．

［13］ Inoki K，Li Y，Zhu T，et al．TSC2 is phosphorylated and inhibited by Akt and suppresses mTOR signaling［J］．Nat Cell Biol，2002，4(9):648-57．

［14］ Huang J，Manning BD．A complex interplay between Akt，TSC2 and the two mTOR complexes［J］．Biochem Soc Trans，2009，37(Pt 1):217-22．

［15］ Niedzwiecka A，Marcotrigiano J，Stepinski J，et al．Biophysical studies of eIF4E cap-binding protein:recognition of mRNA 5＇cap structure and synthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1 proteins［J］．J Mol Biol，2002 ，319(3):615-35．

［16］ Long X，Spycher C，Han ZS，et al．TOR deficiency in C．elegans causes developmental arrest and intestinal atrophy by inhibition of mRNA translation ［J］．Curr Biol，2002，12(17):1448-61．

［17］ Browne GJ，Proud CG．A novel mTOR-regulated phosphorylation site in elongation factor 2 kinase modulates the activity of the kinase and its binding to calmodulin ［J］．Mol Cell Biol，2004 ，24(7):2986-97．