利用16S rRNA基因克隆文庫分析東北自然發酵酸菜中細菌多樣性

曹碧璇，胡濱，劉愛平

(四川農業大學食品學院，四川雅安，625014)

傳統發酵蔬菜主要是利用乳酸菌等微生物進行發酵制作而成，目前是我國產量最高的蔬菜加工產品。東北酸菜以白菜為主要發酵原料，天然附著在白菜表面上的微生物利用白菜中的糖類等營養物質后產酸發酵，從而形成一種特色發酵蔬菜食品。酸菜發酵過程與細菌的生長代謝、汁液與白菜的生物化學作用有極其緊密的聯系，在此過程中白菜細胞內部的化學成分會發生一系列變化［1-2］，從而形成酸菜獨特的風味，其味道咸酸，口感脆嫩，可以增進食欲，幫助消化。

目前，我國對傳統發酵食品中微生物群落組成研究仍然以純培養技術為主，一般是利用純種分離技術篩選某一類群微生物(如乳酸菌)［3-9］。但是，隨著研究的不斷深入和技術的進步，逐漸發現發酵液中微生物的種類實際數量遠遠多于用培養法獲得的種類數，基于純培養的方法不能準確反映復雜樣品中微生物多樣性的真實情況。近年來微生物分子生態學技術得到快速發展，利用這些技術可以避開微生物培養環節，通過提取環境微生物基因組直接從DNA水平研究環境微生物的多樣性和群落結構［10-12］。例如，武俊瑞等(2014)采用16S rRNA基因PCR-DGGE技術開展了傳統東北酸菜發酵液中的微生物多樣性的研究［13］，揭示了傳統酸菜發酵液中微生物的多樣性，及優勢菌群的系統發育關系。本研究在提取發酵液微生物DNA后，PCR擴增16S rRNA基因全長序列，通過建立該基因克隆文庫的方法，進一步研究發酵液中細菌的種類組成，分析優勢菌群結構，以期準確了解東北酸菜發酵液中的微生物資源和酸菜發酵機理，為今后改進發酵工藝和發展相應微生態制劑奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

細菌基因組DNA提取試劑盒、快捷型DNA純化回收試劑盒、2×Power Taq PCR MasterMix、DH5α 感受態細胞(Bioteke);Zero Background TA TOPO Cloning Kit(Clone Smarter);瓊脂粉(Amresco);酵母提取物、胰蛋白胨(Oxoid);DL2000 DNA Marker、溴化乙錠、λDNA-Hind Ⅲ Marker(TaKaRa);Tris-base、EDTANa2、氨芐青霉素等為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Universal HoodII凝膠成像儀，Bio-RAD;臺式離心機1-14，Sigma;SW-CJ-2FD凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;MLS-3780高壓滅菌鍋，SANYO;THZ-98AB恒溫振蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司;μQuant酶標儀，BioTek;ST16R高速冷凍離心機，Thermo Scientific;DYY-10水平電泳儀，北京六一儀器廠;Mastercycler nexus gradient eco PCR擴增儀，Eppendorf;ExF32086V-ULTS超低溫冰箱，Thermo Scientific。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的采集及預處理

樣品采集:樣品釆自遼寧地區農家利用傳統方法制作的自然發酵成熟的酸菜發酵液5份，發酵時間均不低于50 d。

菌體富集:酸菜發酵液樣品用滅菌濾紙過濾以除去酸菜汁中的雜質。取30 mL濾液，4℃ 6 800 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀加入25 mL的PBS緩沖液，在漩渦混勻器上振蕩2 min，6 800 r/min離心10 min，棄上清液，加少量ddH2O洗滌，將沉淀轉移到1 mL的無菌離心管中，4℃，14 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體于-20℃保存。

1.3.2 樣品細菌基因組DNA的快速提取

采用細菌基因組提取試劑盒提取(Bioteke)，具體操作參照說明書。

1.3.3 構建16S rRNA基因克隆文庫

以提取的細菌基因組DNA作為模板，使用細菌通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和 1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)對細菌16S rRNA基因全長進行擴增［14］。PCR反應體系(50 μL):PCR MasterMix 25 μL，引物 27F和1492R 各1 μL，模板 DNA 1μL，加去離子水補齊 50 μL。熱循環反應條件:(1)95℃預熱5 min;(2)95℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30 個循環;(3)72℃延伸10 min。PCR產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產物經純化后，與Zero Background TA TOPO Cloning Kit試劑盒內pCloneEZ-TOPO載體連接，重組質粒轉化到E.coli DH5α中，然后在含50 μg/mL的氨芐青霉素LB固體瓊脂培養基上37℃培養12～16 h。挑取白色單菌落于2 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中37℃搖床振蕩培養12 h，吸取1 μL菌液作為模板，用載體通用引物對其進行PCR擴增，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的克隆子。

1.3.4 16S rRNA基因序列分析

將含有正確克隆子的菌液送中美泰和公司測序。手動刪除所得序列中的載體序列，然后利用GenBank的BLAST-n程序進行相似性比對，尋找與之親緣關系最近的可培養菌種的序列。利用DNAMAN軟件進行多序列比對，相似性≥97%視為同一操作分類單元(operational taxonomicunit，OTU)［15］。使用 MEGA4.0軟件中的程序并采用Neighbor-Joining法構建系統進化樹，并使用Bootstrap(1 000次)對進化樹進行驗證。

2 結果

2.1 發酵液細菌總DNA的提取和16S rRNA基因的PCR擴增

采用細菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取出樣品中的總DNA。選用通用引物27F和1492R對發酵液16S rRNA基因的全長序列進行PCR擴增，擴增產物后經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。實驗結果表明此引物對可以較完整地從樣品微生物基因組DNA中擴增出清晰單一，無非特異性擴增的片段，長度約為1 500 bp，符合細菌16S rRNA基因片段大小。

圖1 酸菜樣品16S rRNA基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene PCR products from Suan-Cai sample

2.2 發酵液16S rRNA基因克隆文庫分析

將克隆文庫中菌液PCR鑒定結果為陽性的菌液測序，去除嵌合體后共98個克隆子為正確克隆子。測得的16S rRNA基因全長序在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)網站上的BLAST-n進行比對。將序列相似性≥97%的序列視作一個OTU，低于97% 的則列為另一個OTU，共劃分為9個OTU(表1)。共有63個(64.29%)克隆子屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，占絕對優勢，其中 OTU1為 Lac.coryniformis，61個克隆子;OTU5和 OTU6分別為Lac.malefermentans和Lac.plantarum，各一個克隆子(圖2)。片球菌屬(Pediococcus)共22個克隆子(OTU2)，占22.45%，鑒定為 P.parvulus。OTU3為枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)，共 8個克隆子，占8.16%，均為 Citr.murliniae。OTU4為梭菌屬(Clostridium)為 2個克隆子，占 2.04%，鑒定為Clos.Intestinale。OTU7，8和9均包含一個克隆子，各占1.02%，分別鑒定為串珠菌屬(Leuconostoc)的Leuc.citreum，無色桿菌屬(Achromobacter)的A.spanius和腸桿菌屬(Enterobacter)的E.cloacae。

表1 所得OTU及與其親緣關系最近的已知菌種Table 1 OTUs from 16S rRNA gene library and their phylogenetic analysis

圖2 酸菜發酵液中16S rRNA基因文庫菌株分布Fig.2 Distribution of microbial genus based on 16S rRNA library of Suan-Cai

2.3 系統發育分析

選取本研究中所占比例較大的OTU1和OTU2的代表序列和其他OTU的所有序列及具有最高相似性的可培養菌種的序列構建系統進化樹(圖3)。所得序列分成兩個門類，分別為Firmicute和Proteobacteria，其中大部分為Firmicute相關的序列(89.8%)。Firmicute類群含有Lactobacillaceae、Leuconostocaceae和Clostridiaceae的序列。其中，Lactobacillaceae的大部分序列屬于 Lactobacillus，bootstrap支持率為100%，其次為Pediococcus。檢測到的Lactobacillus序列分別與Lact.coryniformis subsp.torque、Lact.malefermentans和Lact.plantarum的序列聚類在一起，序列數所占比例最大(62.24%)的OTU1代表序列F2和F3與Lact.coryniformis subsp.torque序列聚為一支，而 OTU2的代表序列 F30(22.45%)與P.parvulus聚類在一起。序列F11、L25和Clostridium intestinale的序列聚類在一起，遠離其他分支，它們與Lactobacillaceae和Leuconostocaceae的序列親緣關系較遠。另外，在 Firmicute類群中，一個序列與Leuc.citreum NR 074694密切相關，相似性達到100%。在Proteobacteria類群中，本研究所得序列分布在兩個分支中，分別由Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria序列構成。Betaproteobacteria亞類中只含有一個與A.spanius密切相關的序列。9個序列與Gammaproteobacteria的Enterobacteriaceae菌株的序列聚類在一起，bootstrap支持率為100%。然而，除了序列R5和F21與Enterobacter ludwigii和Citro.murliniae聚為一支外，其余7個序列單獨聚為兩類。

3 討論

本研究采用構建克隆文庫的方法，對克隆子的16S rRNA基因全長序列進行測序，在此基礎上鑒定酸菜自然發酵液微生物群落組成。從總體來看，東北酸菜自然發酵液中，乳酸菌占絕對優勢，這與以往以大白菜為原料的東北酸菜的相關研究，以及其他蔬菜為原料腌制酸菜的研究結果相一致［7，11-13］。楊洪巖等以黑龍江省綏化地區自然發酵白菜為對象，開展了東北酸菜發酵過程中微生物組成動態的研究，在發酵液中檢測到Acinetobacter、Pseudomonas、Klebsiella、Citrobacter、Leuconostoc、Lactobacillus 等幾個屬和 Betaproteobacteria;而且發酵30 d后，所檢測到的細菌全部為 Lactobacillus［16］。武俊瑞等利用 PCR-DGGE 技術在東北酸菜發酵液中分離和鑒定出Lactobacillus屬的9個種［13］。Miyamoto等在哈爾濱地區酸菜液中分離到乳酸菌的新種(Lact.harbinensisDSM 12745)［17］。本研究選用的發酵液是成熟發酵液(50 d以上)，在發酵液中除檢測到乳酸菌屬的3個種外，還檢測到Pediococcus parvulus、Citrobacter murliniae、Clostridium intestinale、Leuconostoc citreum、Achromobacter spanius和 Enterobacter cloacae。

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the complete 16S rRNA gene sequences

美國的學者們利用形態學和生理生化反應鑒定出以圓白菜為原料的酸菜初期發酵液中包含Leuc.mesenteroides、Lact.brevis、P.pentosaceus和 Lact.plantarum等，而在發酵后期則主要為Lact.Plantarum［18］。這些屬在本研究中也均被檢測到，只是所屬的種不同。田偉等(2012)通過構建16S rRNA基因文庫，研究了四川泡菜發酵液中細菌群落組成，發現所有的克隆子均屬于乳酸菌，主要分布于Lactobacillus和Pediococcus兩個屬，且Lactobacillus屬占有絕對的數量優勢［19］。在本研究中，Lactobacillus和Pediococcus兩個屬的克隆子分別占64.29%和22.45%，也占絕對優勢，與以往的研究基本一致，但本研究中的優勢種為Lact.coryniformis、P.parvulus 和 C.murliniae，而 Lact.plantarum雖然也被檢測到，但克隆子數量遠遠低于這幾個種，這與以往的采用純培養和PCR-DGGE技術的一些研究結果有些不同［11-13，20］。其主要原因可能是選用的研究方法和選取的實驗材料不同所致。在酸菜生產過程，微生物多樣性和群落組成結構一般會隨著發酵的進程而發生變化［16，21］，一些真菌在其中也會起一定的作用［22］，在后續的研究中應該不斷補充和完善，以便更全面地了解酸菜的發酵機理。

另外，本研究采用16S rRNA基因的全長序列構建克隆文庫，序列較長(1.5 kb)，測序后進行序列比對鑒定物種時準確性較高，可以較真實地反映實驗樣品的微生物群落結構組成，而且還能提供很多傳統純培養方法所不能提供的信息。準確掌握發酵液微生物組成結構對于深入了解酸菜發酵機理、指導生產以及篩選高效酸菜發酵菌劑都有重要意義。

4 結論

本研究以傳統東北酸菜為對象，采用構建16S rRNA基因克隆文庫的方法研究了酸菜成熟發酵液中細菌的多樣性和群落的組成結構。酸菜發酵液中含有的主要微生物種類為Lact.coryniformis、P.parvulus、Citr.murliniae、Clos.intestinale、Lact.malefermentans、Lact.plantarum、Leuc.citreum、A.spanius和 E.cloacae。其中，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcuss)和枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)為優勢菌，分別占64.29%，22.45%和8.16%。

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