復配保鮮劑對凍藏魷魚品質變化的影響*

劉妙，楊憲時，李學英，遲海，黃洪亮

1(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海，200090)2(上海海洋大學食品學院，上海，201306)

魷魚(squids)，也稱槍烏賊、柔魚，是軟體動物門頭足綱槍形目槍烏賊科的總稱。我國每年魷魚捕獲量達到36～43萬t，占據世界魷魚捕獲量的36%左右，是我國重要的遠洋捕撈經濟動物［1］。魷魚具有高蛋白、低脂肪、低熱量的優點，同時還富含鈣、牛磺酸、磷、VB1等多種人體所需的營養成分，其營養價值毫不遜色于牛肉和金槍魚［2］。

對于魷魚來說，冷凍保藏是最主要的保藏方法，能在長期貯藏中極大地保持魷魚的品質。冷凍環境下不僅可以降低魷魚蛋白內部自身的各類生化反應速率，還可以降低微生物的繁殖速率［3］。但是冷凍保藏容易使魚肉蛋白發生冷凍變性，使魚肉的持水性、膠凝性、口感和營養價值都產生不良的變化。在水產品中加入保鮮劑可以有效防止蛋白質變性，延長魷魚的保質期。普通的保鮮劑性能單一，保鮮效果具有一定的局限性。復合保鮮劑是當前保鮮劑研究的主要方向之一，但是復合保鮮劑對凍藏魷魚的保鮮效果的研究還很少。路鈺希等［3］選取了D-山梨醇、乳酸鈉、三聚磷酸鹽、混合磷酸鹽和海藻糖5種保鮮劑，探討了單一保鮮劑對凍藏條件-20℃下魷魚品質變化的影響。本研究在該保鮮劑單因素試驗的基礎上，選取保鮮效果較好的海藻糖、乳酸鈉、混合磷酸鹽進行各種比例復配，以持水率(WHC)、鹽溶性蛋白質含量(SSP)、活性巰基含量為指標，并結合色差試驗和質構，分析魷魚在-20℃凍藏條件下的品質變化。旨在篩選出較優配比的復合保鮮劑來提高魷魚質量，延長魷魚的貨架期，為魷魚保鮮劑的開發提供基本的數據支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

魷魚為2013年9月在經緯度為155°42'E，42°55'N的公海區域捕撈的北太平洋魷魚，船上凍結后貯藏-20℃運至實驗室，-80℃貯藏備用。

海藻糖、乳酸鈉、混合磷酸鹽［m(三聚磷 酸鈉)∶m(焦磷 酸鈉)∶m(六偏磷 酸鈉)=2∶2∶1］、考馬斯亮藍 G-250、5，5’二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、三羥甲基氨基甲烷、牛血清蛋白、無水乙醇、H3PO4、KCl、KH2PO4、NaOH、HCl等，試劑均為分析純或化學純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

JYL-350絞肉機，上海九陽股份有限公司;IUL均質機，西班牙;5810R高速冷凍離心機，Eppendorf德國;CR-400色差儀，CHROMA METER日本;TMS-Pro質構儀，Food Technology Corporation美國;721可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;HH-8恒溫水浴鍋;MPR-414F冰箱，Sanyo日本;YP200N電子天平，上海菁海儀器有限公司。

1.2 樣品處理與貯藏實驗

魷魚從-80℃冰箱中取出，流水解凍。去除頭部、內臟和皮，取胴體切塊備用。將各組樣品放入對應濃度的復配保鮮劑中浸漬10 min，復配保鮮劑溶液與魷魚比例(mL∶g)為 2∶1［4］，對照組在蒸餾水中浸漬10 min。取出魷魚瀝干，根據保鮮劑濃度依次放入保鮮袋中，貯藏于(-20±0.1)℃冰箱中。每隔10 d隨機抽樣進行持水率、鹽溶性蛋白質含量、活性巰基含量、色差和最大剪切力測定，共貯藏60 d。測定時將凍藏魷魚流水解凍。

保鮮劑的添加量均符合GB 2760-2011食品添加劑使用衛生標準，復配保鮮劑溶液添加水平如表1所示。

表1 魷魚復配保鮮劑L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Design of squid complex fresh-keeping orthogonal experiment L9(34)

1.3 實驗方法

1.3.1 正交試驗

選用海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽，以持水力、鹽溶性蛋白質含量、活性巰基含量為測試指標，按公式(1)和公式(2)進行評分。并采用三因素三水平L9(34)進行正交試驗(表2)，同時進行方差分析，根據分析結果確定復配保鮮劑的最佳配比。

式中:指標值為某次測量的實際值;指標最小值為該指標所有測量結果中的最小值;指標最大值為該指標所有測量結果中的最大值。

1.3.2 持水率的測定

［5］略作修改，采用加壓重量法，對魷魚的持水率進行測定。取1 cm厚質量約為10 g的肉塊，上下各墊10層濾紙，用TMS-Pro質構儀，35 kg壓力壓5 min，壓完后稱其質量，計算持水率［公式(3)］:

式中:m為加壓前樣品的質量，g;m1為加壓后樣品的質量，g。

1.3.3 鹽溶性蛋白含量的測定

參考文獻［6］作適當修改，用絞肉機把魷魚絞碎，取4 g裝入均質袋中，加入10倍量的冰冷的0.6 mol/L 的KCl溶液，pH 7.2，均質2 次，每次30 s，在4℃下提取2 h，然后離心(8 000 r/min，20 min，4 ℃)。收集上清液，加入3倍量的冷水再次離心(8 000 r/min，20 min，4℃)，所得上清液即為鹽溶性蛋白溶液。采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，用牛血清蛋白測定標準曲線(標準曲線為y=0.005 7x+0.014 4，R2=0.998 3)，計算結果以mg/g表示，每組試驗做3個平行。

1.3.4 肌動球蛋白的提取

肌動球蛋白根據MacDonald等的方法制備。取絞碎后的魷魚肉4 g，裝入均質袋中，加入40 mL冰冷的(4℃)0.6 mol/L的 KCl溶液，pH 7.0。均質4 min，每均質20 s，放在冰中間歇20 s，防止均質過熱。然后離心(8 000 r/min，30 min，0 ℃)，收集上清液加入3倍量的冰冷的去離子水稀釋肌動球蛋白。再離心(8 000 r/min，20 min，0 ℃)，所得沉淀加入等量的冰冷的1.2 mol/L的KCl溶液，pH 7.0，在0℃下攪拌 30 min，不溶部分再次離心(8 000 r/min，20 min，0℃)［7］。所得肌動球蛋白溶液用0.6 mol/L KCl溶液調節到4 mg/mL，冷藏備用。

1.3.5 活性巰基含量的測定

參照 Benjakul和 Ellman等［7］方法，采用 DTNB法測定活性巰基含量。取1mL的4 mg/mL肌動球蛋白溶液，加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 6.8。取4 mL混合物，加入0.4 mL 0.1%5，5’二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶液，在40℃下反應25 min，溶液在412 nm下測定吸光值。空白用0.6 mol/L KCl溶液代替。每組試驗做3個平行。活性巰基含量按公式(4)計算:

式中:c0為巰基的摩爾濃度，mol/g;A為吸光值;D為稀釋倍數;ε為吸光系數，L/mol·cm;c為蛋白質量濃度，mg/mL。

1.3.6 色差的測定

取完整肉塊，用色差儀測定樣品的 L*、a*、b*值。其中，L*表示亮度;+a*表示紅，-a*表示綠;+b*表示黃，-b*表示藍。每組樣品測定10次。

1.3.7 剪切力的測定

取1 cm寬1 cm厚的魷魚條，采用TMS-Pro型質構儀，通過Texture Lab Pro軟件測定魷魚的剪切力。最大力量感應量程:1 000 N，回程距離:20 mm，測試速度:60 mm/min，每組樣品測定10次。

1.4 數據分析和處理方法

實驗數據采用Microsoft Excel 2007進行統計分析。用SPSS 17.0進行方差分析。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 實驗結果與討論

2.1 復配保鮮劑最佳配比的確定

魷魚復配保鮮劑正交試驗結果及結果分析如表2、表3所示。由表2可知，所選的3種保鮮劑對魷魚保鮮效果主次作用為:A＞B＞C，即海藻糖＞乳酸鈉＞混合磷酸鹽。方差分析結果如表3所示，海藻糖和乳酸鈉的添加量對正交試驗結果有極顯著的影響(P＜0.01)，混合磷酸鹽的添加量對正交試驗結果有顯著影響(P＜0.05)。

表2 魷魚復配保鮮劑正交試驗L9(34)第60天試驗結果Table 2 Results of squid complex fresh-keeping agents orthogonal experiment L9(34)at the 60thday

表3 魷魚復配保鮮劑正交試驗L9(34)第60天結果的方差分析Table 3 Variance analysis of squid complex fresh-keeping agents orthogonal experiment L9(34)at the 60thday

以綜合評分作為總指標進行直觀分析得出7號試驗(A3B3C2)效果最好，即海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.4%。在本實驗中綜合分越大越好，各因素應取最大K值所對應的水平，即A3B3C3，海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.5%。該方案不包括在9組試驗中，所以對直觀分析最優組(A3B3C2)和方差分析最優組(A3B3C3)進一步做驗證試驗，對魷魚添加保鮮劑后分別凍藏60 d，試驗結果如表4所示。從表4可以看出，方差分析最優組(A3B3C3)優于直觀分析最優組(A3B3C2)，因此復配保鮮劑最佳組合為A3B3C3，即海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.5%。A3B3C3與A3B3C2相比，持水力有顯著差異(P＜0.05)，鹽溶性蛋白含量和活性巰基含量差異不顯著(P＞0.05)。這可能是因為混合磷酸鹽的保水性能較好，混合磷酸鹽濃度的提高使得魷魚失水率下降，持水力增強。

表4 驗證實驗結果Table 4 Results of verification tests

2.2 復配保鮮劑對凍藏魷魚持水率的影響

持水率反映了肉制品的持水能力，持水率對肉制品的顏色、多汁性、柔嫩程度等食用品質有直接影響［8-9］。魷魚的持水率越高，說明持水能力越好，反之持水率越低，持水能力越差。Conalves等人［10］認為冷凍過程中冰晶的形成，使肌肉組織細胞結構的破壞，導致肉品持水性能下降。圖1是魷魚持水率隨凍藏時間的變化。從圖1可以看出，隨著凍藏時間的延長，復配組和空白組的持水率都越來越低，表明魷魚的持水能力越來越差。復配組和空白組持水率相比差異極顯著(P＜0.01)，魷魚的 WHC初始值為(93.79±0.90)%，凍藏60 d后，復配組持水率為(87.76±0.72)%，空白組持水率僅為(77.04±0.87)%，WHC分別下降了6.03%和16.75%。三聚磷酸鈉與焦磷酸鹽可以與肌肉蛋白相互作用，促使肌動球蛋白解離成肌動蛋白和肌球蛋白。Nakamura等人［11］認為，肌動球蛋白解離成肌動蛋白和肌球蛋白會導致WHC的提高。說明復配組保鮮劑可以使凍藏魷魚保持好的持水能力。

圖1 魷魚凍藏中持水率的變化Fig.1 Change of water-holding rate from frozen squid

2.3 復配保鮮劑對凍藏魷魚鹽溶性蛋白含量的影響

蛋白質是魷魚肌肉的主要成分，占到了胴體含量的16%～18%。按蛋白質對溶劑的溶解性不同，可分為水溶性蛋白質、鹽溶性蛋白質、堿溶性蛋白質、水不溶性蛋白質。圖2表示了復配保鮮劑對凍藏魷魚鹽溶性蛋白含量的影響。

圖2 魷魚凍藏中鹽溶性蛋白含量的變化Fig.2 Change of salt soluble protein content from frozen squid

從圖2可以看出，隨著凍藏時間的增加，復配組和空白組的鹽溶性蛋白含量均呈下降趨勢。復配組與空白組鹽溶性蛋白含量差異極顯著(P＜0.01)。魷魚的鹽溶性蛋白質含量初始值為(56.88±1.02)mg/g，凍藏60 d后，復配組SSP含量為(28.86±1.25)mg/g，空白組SSP含量為(14.96±1.16)mg/g。在整個凍藏過程中，復配組和空白組SSP含量分別下降了49.26%和73.70%。說明復配組保鮮劑能夠減緩鹽溶性蛋白含量下降速率，有效防止蛋白質冷凍變性。

鹽溶性蛋白也稱肌原纖維蛋白，包括肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白、輔肌動蛋白等。一般認為，凍藏過程中形成的二硫鍵、氫鍵和疏水鍵等導致了蛋白質的鹽溶性下降。曾名勇等［12-13］認為，在凍藏過程中肌原纖維蛋白含量的下降是由于蛋白質的部分結合水形成冰晶，導致肌動球蛋白分子之間相互形成非共價鍵，進而形成超大分子的不溶解的凝集體所致。另外，鹽溶性蛋白變性后，會產生一種在高離子強度下不能溶出但在堿液中可以溶出的蛋白質，即堿溶性蛋白質，也會導致鹽溶性含量在凍藏過程中下降。Sompongese等［14］認為，巰基氧化形成的二硫鍵會導致肌球蛋白重鏈的聚合，降低其鹽溶性。

2.4 復配保鮮劑對凍藏魷魚活性巰基的影響

巰基含量反映了蛋白質變性聚合的程度。圖3表示了復配保鮮劑對凍藏魷魚活性巰基含量的影響。

圖3 魷魚凍藏中活性巰基含量的變化Fig.3 Change of active sulfhydryl group content from frozen squid

Sompongse等［14］認為，巰基含量在凍藏過程中下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纖維蛋白空間結構發生改變，使埋藏在分子內部的巰基暴露出來，進而被氧化成二硫鍵，導致巰基含量的減少。從圖3可以看出，隨著凍藏時間的增加，復配組和空白組的活性巰基含量都呈下降的趨勢。與空白組相比，復配組活性巰基含量有顯著差異(P＜0.05)。初始點的魷魚活性巰基含量為(7.12±0.03)×10-5mol/g，凍藏至60 d時，復配組活性巰基含量下降至(5.16±0.04)×10-5mol/g，空白組活性巰基含量為(3.15±0.05)×10-5mol/g。在整個凍藏過程中，復配組的活性巰基含量下降了1.96×10-5mol/g，空白組下降了3.97×10-5mol/g，空白組的活性巰基含量減少值是復配組活性巰基含量減少值的2倍。上述結果表明，復配組保鮮劑能夠很大程度的抑制巰基的氧化，提高抗氧化性和凍藏穩定性，保持凍藏魷魚的品質。

2.5 復配保鮮劑對凍藏魷魚色澤的影響

表5是凍藏魷魚復配組和空白組的L*，a*，b*值。復配組和空白組L*值相關系數為0.903，相關性大，a*值，b*值相關系數很小。解凍后的魷魚顏色略發白，顏色較為一致，故選定L*值來進行其色澤的評價。從表5可以看出，隨著凍藏時間的增加，復配組和空白組的L*值都緩慢下降，復配組和空白組L*值差異極顯著(P＜0.01)。Park等和 Yang等［15-16］認為L*值容易受到含水量的影響，含水量越大，L*值越大。Conalves等人［10］認為含水量高的肉品表面游離水分增加，對光的反射效果增強，從而造成L*值的升高。復配組持水力高，水分含量高，所以L*值大。復配組L*值較大，肉更加有光澤，說明復配保鮮劑有助于保持凍藏魷魚肉品的光澤度。

表5 復配保鮮劑對凍藏魷魚色澤的影響Table 5 Effect of complexantistaling agents on color of frozen squid

2.6 復配保鮮劑對凍藏魷魚質構的影響

本研究采用TPA方法對魷魚肌肉組織的硬度(最大剪切力)特性進行分析。圖4表示了復配保鮮劑對魷魚最大剪切力的影響。

圖4 魷魚凍藏中最大剪切力的變化Fig.4 Change of maximum shear stress from frozen squid

如圖4所示，復配組和空白組的最大剪切力都隨凍藏時間的延長而降低，復配組的下降速度低于空白組，復配組和空白組差異顯著(P＜0.05)。影響剪切力的因素有很多，pH、脂質氧化、酶水解、預處理方式、甲醛的形成、碳酸鹽、冷凍保護劑等都會對剪切力產生影響［17］。復配保鮮劑對于減緩魷魚質構變化有一定的作用，但其對魷魚咀嚼性和彈性方面的影響仍需進一步研究。

3 結論

(1)本文選取保鮮效果較好的海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽進行復配，通過3因素3水平的L9(34)的正交試驗，以持水率、鹽溶性蛋白質含量、活性巰基含量為指標，用綜合評分法分析了魷魚在-20℃凍藏條件下的品質變化。根據正交試驗結果和方差分析，各因素對凍藏魷魚保鮮效果影響的主次順序為海藻糖＞乳酸鈉＞混合磷酸鹽。海藻糖和乳酸鈉的添加量對正交試驗結果有極顯著的影響(P＜0.01)，混合磷酸鹽添加量對試驗有顯著影響(P＜0.05)。實驗得出的復配保鮮劑的最佳配比濃度是海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.5%。

(2)在-20℃凍藏60 d后，復配組和空白組的WHC、SSP、活性巰基含量分別為87.76%、77.04%;28.86、14.96 mg/g;5.16 × 10-5、3.15 × 10-5mol/g。復配組和空白組WHC和SSP含量呈極顯著差異(P＜0.01)，活性巰基含量差異顯著(P＜0.05)。通過驗證，發現復配保鮮劑對于提高凍藏魷魚的持水率，減緩鹽溶性蛋白含量和活性巰基含量的下降速率有顯著的作用。同時復配保鮮劑有助于保持凍藏魷魚肉品的光澤度，減緩魷魚質構變化。說明該復配保鮮劑對-20℃貯藏條件下的魷魚保鮮效果顯著。

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