利用番茄廢渣混菌固體發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料*

鞏莉，華穎，劉大群，陳文烜

1(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江杭州，310021)

2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥，230031)

2011年，我國成為世界第一大番茄制品出口國，到2012年我國已建成番茄加工生產(chǎn)線317條，番茄醬的年產(chǎn)量突破200萬t，出口份額約占全球市場的40%［1］。番茄渣大多為番茄醬加工副產(chǎn)品，全國年產(chǎn)量超過50萬t。番茄廢渣生產(chǎn)季節(jié)性強(qiáng)，極易造成積壓、浪費;同時水分含量大(達(dá)到75%以上)，易發(fā)霉變質(zhì)，污染環(huán)境。鮮番茄渣酸度低(pH約為4.3左右)，并含有單寧、果膠等抗?fàn)I養(yǎng)因子，直接飼喂動物，易造成畜禽消化不良，導(dǎo)致畜禽產(chǎn)量、質(zhì)量降低。

目前我國蛋白質(zhì)飼料缺口每年至少達(dá)1 200萬t［2］，依靠傳統(tǒng)方式提供飼料已遠(yuǎn)不能滿足市場的需要。菌體蛋白是一種新興的蛋白來源，通過微生物發(fā)酵農(nóng)業(yè)廢棄物實現(xiàn)蛋白飼料的生產(chǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)、實用、高效的蛋白飼料生產(chǎn)方法。微生物發(fā)酵既可以解除纖維素、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，又可以通過發(fā)酵產(chǎn)生多種酶，改善發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)，提高營養(yǎng)價值及蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的消化率［3-6］。目前研究較多的有馬鈴薯、秸稈等，且大多使用幾種菌混合發(fā)酵來實現(xiàn)原料的更好利用［7-9］。用番茄廢渣作為菌體蛋白飼料生產(chǎn)原料的研究還較少，本實驗以番茄廢渣為原料，以黑曲霉、綠色木霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母為出發(fā)菌，通過階段性發(fā)酵，優(yōu)化組合，以期獲得高蛋白質(zhì)含量的番茄廢渣飼料。

1 材料與設(shè)備

1.1 原料和試劑

番茄廢渣購自寧波銅錢橋食品開發(fā)有限公司，為番茄醬生產(chǎn)廢渣，取當(dāng)天產(chǎn)生的廢渣，分裝并置于-20℃冰箱保存;麩皮，為市售小麥麩皮。

甲基纖維素鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;3，5-二硝基水楊酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;多聚半乳糖醛酸，阿法埃莎化學(xué)有限公司;酪氨酸，上?？▋?yōu)生物技術(shù)有限公司，以上試劑均為分析純試劑。

1.2 菌種

黑曲霉 3.031 6(Aspergillus niger)，綠色木霉3.294 2(Trichoderma viride)，熱帶假絲酵母2.058 7(Candida tropicalis)，產(chǎn)朊假絲酵母2.028 1(Candida utilis)，購于中科院普通微生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基

酵母菌培養(yǎng)基:葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母提取物0.5%，121℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩Ｒ后w培養(yǎng)基用于菌種活化，固體培養(yǎng)基用于菌種活菌數(shù)檢測、菌落觀察。

PDA:將馬鈴薯去皮，切成小塊，添加1 000 mL水，煮沸30 min，用紗布將渣濾去，并將水補(bǔ)足至1 000 mL，葡萄糖 20.0 g、瓊脂 15.0 g、pH 自然，121℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩Ｒ后w培養(yǎng)基用于菌種活化培養(yǎng)，固體用于菌落形態(tài)觀察。

Czapek’s瓊脂:方法參照標(biāo)準(zhǔn)配制，pH調(diào)至6.0～6.5，121℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆?。液體培養(yǎng)基用于菌種活化培養(yǎng)，固體用于菌落形態(tài)觀察。

本研究所涉及番茄殘渣培養(yǎng)基均為在上述幾種培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加適當(dāng)比例的番茄殘渣或麩皮(具體比例視具體實驗要求確定)。

1.4 儀器與設(shè)備

Metrohm 877 Titrino plus自動滴定儀，瑞士萬通;GBC Cintra 20紫外-可見分光光度計，澳大利亞 GBC公司;Thermo MR23i高速低溫冷凍離心機(jī)，法國JOUAN公司;UDK127型高效凱式定氮儀，嘉盛(香港)科技有限公司;LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;HPX-9162 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司;SPX-150C型恒溫恒濕箱，上海博訊實業(yè)有限公司;梅特勒-托利多 HB43-S鹵素水分測定儀，瑞士萬通。

2 實驗方法

2.1 菌種的活化

用75%酒精脫脂棉對安瓿管表面消毒，火焰加熱頂端，滴1滴無菌水使之裂開，鑷子敲下。用無菌試管吸取0.3～0.5 mL液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管，振蕩，吸取全部菌懸液于2只培養(yǎng)試管中，28～30℃培養(yǎng)3～4 d使菌株復(fù)活，再經(jīng)過3代斜面純培養(yǎng)。

2.2 生長曲線的制作

酵母菌:光電比濁法，在起初4 h內(nèi)，每小時取樣1次，以后每2 h取樣1次，于600 nm處測定菌液的OD值，并繪制生長曲線。

霉菌:采取平板菌落面積法，28～30℃培養(yǎng)，每4 h測量1次菌落半徑。

2.3 刺激圈實驗

2.3.1 可行性實驗

將綠色木霉、黑曲霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母分別接種在使用番茄廢渣制作的固體培養(yǎng)基中，28～30℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌種的生長狀況。

2.3.2 共生長實驗

將經(jīng)過稀釋的酵母菌281和587分別接種在酵母菌培養(yǎng)基和番茄廢渣培養(yǎng)基上，將牛津杯放在培養(yǎng)皿中間，將液體培養(yǎng)的綠色木霉和黑曲霉分別取0.2 mL接種到已涂布281和587的培養(yǎng)基上(接在牛津杯中)，培養(yǎng)4～5 d，觀察菌落狀態(tài)。

將綠色木霉和黑曲霉分別點接在酵母菌培養(yǎng)基和番茄廢渣培養(yǎng)基上，待菌落長出，在菌落中央放上牛津杯，取0.2 mL酵母菌，接種到牛津杯中，培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落狀態(tài)。

2.4 單菌種發(fā)酵實驗

2.4.1 番茄廢渣及麩皮最佳配比試驗

分別接種兩種霉菌于添加不同比例麩皮的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基總重75 g，再分別添加硫酸銨1 g、尿素0.5 g，培養(yǎng)4 d后分別測定發(fā)酵液中總糖、還原糖以及蛋白質(zhì)的含量，以確定番茄廢渣的添加量。

2.4.2 發(fā)酵時間試驗

在2.4.1所確定的最佳原料比例的條件下分別接種兩種霉菌，每隔24 h取1次樣，測定發(fā)酵液中總糖、還原糖的含量，確定最佳的酵母菌接種時間(即糖分含量達(dá)到最高的時間)。

2.4.3 霉菌發(fā)酵能力的測定

在2.4.1確定的條件下分別接種兩種霉菌發(fā)酵，每隔24 h取樣，測定發(fā)酵產(chǎn)物果膠酶和纖維素酶的含量，并在2.4.2所確定的時間測定還原糖和總糖含量，比較兩種菌的發(fā)酵能力。

2.4.4 酵母菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白能力的實驗

在15%麩皮添加量的條件下，分別接種兩種酵母菌，每隔24 h取1次樣，測定發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶及蛋白質(zhì)的含量，比較酵母菌的發(fā)酵能力。

2.5 混菌種發(fā)酵實驗

2.5.1 霉菌復(fù)配

根據(jù)試驗2.4的結(jié)果，對綠色木霉和黑曲霉按照不同比例復(fù)配，每24 h取樣，測定總糖、還原糖含量，在發(fā)酵4 d后測定蛋白質(zhì)含量，確定最佳的復(fù)配比例及最佳的酵母菌接種時間。

2.5.2 添加酵母菌發(fā)酵試驗

在試驗2.5.1的基礎(chǔ)上，添加最佳比例的黑曲霉和綠色木霉發(fā)酵，到最佳發(fā)酵時間，分別添加，281、587、281∶587=1∶1、1∶2、1∶3的酵母菌，以后每隔 24 h測定蛋白質(zhì)及還原糖和總糖的含量，確定最佳的菌種比例及時間。

2.6 指標(biāo)測定方法

總糖和還原糖:參考鄭遠(yuǎn)斌的測定方法，平行測定3次。

蛋白質(zhì):參考 GB 5009.5［11］，使用凱式定氮儀，每次取樣0.6～0.7 g，平行測定2次。

纖維素酶:參考 NY/T 912-2004［12］的方法，樣品研磨粉碎，取1 g測定，平行測定3次。

果膠酶:參考曹健康［13］的方法，發(fā)酵產(chǎn)品粉碎，取1 g處理測定，平行測定3次。

蛋白酶:參考張長霞和 SB/T ISO17-1999［14］的方法，平行測定3次。

水分測定:使用鹵素水分測定儀，平行測定3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳接種時間及刺激圈實驗

3.1.1 最佳接種時間的確定

由生長曲線可知(圖未列出)，霉菌的生長曲線呈對數(shù)型，在起初24 h內(nèi)緩慢生長，24 h后迅速生長，48 h后進(jìn)入生長旺盛期，細(xì)胞代謝最旺盛，代謝產(chǎn)物豐富，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分足夠滿足菌落生長，菌落周圍的菌絲體生長旺盛，故選取培養(yǎng)48 h左右的菌落周圍菌絲體作為接種原菌，并選擇此時期作為添加酵母菌的最佳時期。

酵母菌在生長開始6 h內(nèi)生長較緩慢，7～14 h菌種生長迅速，進(jìn)入對數(shù)生長期，此期間細(xì)胞生長速度最快，代時最短，酶的活力最強(qiáng)，所以后續(xù)接種實驗中選擇培養(yǎng)12 h左右的菌種接種，可實現(xiàn)微生物的最有效生長繁殖和對原材料的最好利用。16～24 h內(nèi)酵母菌的生長處于穩(wěn)定期，期間代時延長，細(xì)胞生長能力衰弱，繁殖速度與死亡速度基本相等，菌體數(shù)目達(dá)到最大值，這個期間是收獲細(xì)胞的最佳時期。24 h后菌落進(jìn)入衰落期，活菌數(shù)目下降。

3.1.2 可行性實驗結(jié)果

4種菌均可利用番茄廢渣制成的培養(yǎng)基生長，與自身相應(yīng)培養(yǎng)基比較，雖生長稍慢，但最終均可達(dá)到生長較旺盛狀態(tài)，說明4種菌株均可利用番茄廢渣滿足自身的生長需求，利用番茄廢渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料是可行的。

3.1.3 共生長實驗結(jié)果

4種菌種兩兩之間是可以共生的。刺激圈大小:熱帶假絲酵母+綠色木霉＞產(chǎn)朊假絲酵母+綠色木霉＞產(chǎn)朊假絲酵母+黑曲霉＞熱帶假絲酵母+黑曲霉，說明熱帶假絲酵母和綠色木霉的共生效果最佳。

在先接種霉菌再接種酵母菌的實驗中發(fā)現(xiàn)，在生長旺盛的霉菌培養(yǎng)基中接種酵母菌，酵母菌可以生長，有明顯的生長圈，說明霉菌的代謝產(chǎn)物可以有效地刺激酵母菌的生長，即酵母菌可以利用霉菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行自身的生長。

3.2 單菌發(fā)酵實驗

3.2.1 番茄廢渣及麩皮最佳配比試驗

由表1可知，隨著麩皮添加量的增加，產(chǎn)物中總糖和還原糖的含量逐步增大，說明麩皮的添加顯著影響著微生物的生長，對發(fā)酵起著重要的作用。

表1 不同麩皮添加量下發(fā)酵產(chǎn)品的還原糖、總糖變化情況Table 1 The influence of bran addition on reducing sugar and total sugar

圖1所示為減去原料所含氮之后的蛋白質(zhì)增加量，可見發(fā)酵后產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量有明顯的增加，說明通過微生物發(fā)酵提高蛋白質(zhì)含量的實驗是可行的，在麩皮添加量為15%時，蛋白質(zhì)增加最明顯，即此時微生物對原料的利用最充分，發(fā)酵效果最好，故選取麩皮添加量為15%進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 不同麩皮添加量發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)增加量Fig.1 The increment of protein under different material

3.2.2 發(fā)酵時間的確定

在麩皮添加量為15%條件下，分別接種兩種霉菌，每隔24 h取1次樣，測定發(fā)酵液中總糖、還原糖的含量，如表2所示。

表2 還原糖和總糖含量隨發(fā)酵時間變化情況Table 2 The influence of fermentation time on reducing sugar and total sugar

發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生兩種酶系:酶系1和酶系2，酶系1將番茄廢渣成分分解成可溶性糖，酶系2將這種可溶性的糖轉(zhuǎn)化為還原糖供微生物生長利用。由表2可知，在發(fā)酵初期，還原糖和總糖含量都呈迅速上升趨勢，在發(fā)酵2 d后，總糖含量開始下降，還原糖含量趨于穩(wěn)定，說明體系內(nèi)的物質(zhì)被分解利用，在第2 d左右分解成的可溶性糖含量較高，此時是菌種生長的最佳時期，且根據(jù)霉菌的生長曲線可以看出，霉菌在48 h左右呈旺盛生長狀態(tài)，所以選在接種霉菌第2 d后接種培養(yǎng)12 h的酵母菌，此時體系內(nèi)溶性糖含量較高，被霉菌分解利用的較少，可供酵母菌迅速生長。

對發(fā)酵過程的果膠酶和纖維素酶進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 果膠酶活隨發(fā)酵時間變化情況Fig.2 The influence of fermentation time on pectinase activity

由圖2和圖3可知，果膠酶和纖維素酶的含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行均先上升后下降，且在第2天達(dá)到最大值，后迅速下降，這個實驗結(jié)果跟還原糖和總糖的變化情況一致，說明在第2天，酶系1活性最強(qiáng)，果膠和纖維素被分解利用的最多，得到的總糖最多，在發(fā)酵第2天是接種酵母菌的最佳時機(jī)。由實驗結(jié)果可知黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶活和纖維素酶活力都高于綠色木霉，說明黑曲霉較綠色木霉有更強(qiáng)的分解纖維素和果膠的能力，更適于番茄廢渣的分解利用。

圖3 纖維素酶活隨發(fā)酵時間的變化情況Fig.3 The influence of fermentation time on cellulose activity

對發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析比較，從而考察酵母菌利用番茄廢渣生長能力，結(jié)果見圖4和圖5。酸性蛋白酶是影響植物蛋白的利用率和發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量的重要因素，酸性蛋白酶活性較高的菌種植物蛋白的消化率和氨基酸含量都相對較高，所以應(yīng)選擇酸性蛋白酶活力較高的菌株，以得到更優(yōu)的產(chǎn)品。

圖4 蛋白酶活隨發(fā)酵時間變化情況Fig.4 The influence of fermentation time on protease activity

由圖4和圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶的活性逐步增強(qiáng)，在第3天以后趨于穩(wěn)定狀態(tài)，且產(chǎn)朊假絲酵母的蛋白酶活性高于熱帶假絲酵母。而蛋白質(zhì)含量則先上升后下降，在第3天達(dá)到最大值，隨后緩慢下降，這可能是由于在第4天后培養(yǎng)基中供微生物生長發(fā)育的原料不足，酵母菌無法再進(jìn)行生長繁殖，且此時酵母菌的生長處于衰弱期，所以選擇在第4天作為收獲期。

圖5 蛋白質(zhì)含量隨發(fā)酵時間的變化情況Fig.5 The influence of fermentation time on protein

3.3 混菌種發(fā)酵實驗

3.3.1 霉菌復(fù)配

對綠色木霉和黑曲霉按照不同比例進(jìn)行復(fù)配，每24 h取1次樣，總糖、還原糖的變化情況如圖6和圖7所示。

圖6 不同配比菌種發(fā)酵產(chǎn)品還原糖含量Fig.6 The reducing sugar content of solid medium composite bacteria fermentation

由圖6和圖7可知，還原糖和總糖的含量都是先上升后下降，還原糖在第3天達(dá)到最大值，而總糖在第2天達(dá)到最大，這可能由于在發(fā)酵第2天，系統(tǒng)中酶系1活性最高，將纖維素等大分子物質(zhì)分解成總糖的能力強(qiáng)，糖含量高，而此時霉菌處于開始迅速增長期，所以選擇在第2天接種酵母菌。其中綠色木霉和黑曲霉比例為1∶2時，還原糖和總糖的含量最高，且此時糖分的含量分別高于綠色木霉和黑曲霉單獨發(fā)酵時的含量(表2)，所以選取綠色木霉與黑曲霉比例1∶2為最佳配比。

圖7 不同配比菌種發(fā)酵產(chǎn)品總糖含量Fig.7 The total sugar content of solid medium composite bacteria fermentation

3.3.2 添加酵母菌發(fā)酵試驗

由圖8可知，蛋白質(zhì)的含量總體呈上升趨勢，在第4天達(dá)到最大值，后處于穩(wěn)定狀態(tài)，添加酵母菌后，單獨添加熱帶假絲酵母的培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量較高，同時高于只添加霉菌單獨發(fā)酵的培養(yǎng)基，所以選擇添加霉菌后單獨添加熱帶假絲酵母為最佳發(fā)酵方案。

圖8 不同配比菌種發(fā)酵蛋白質(zhì)含量Fig.8 The protein content of different composite baeteria fermentation

4 討論

微生物是個龐大的體系，其結(jié)構(gòu)與功能也是多樣化的，某些微生物對特定的底物有強(qiáng)的降解能力，但卻缺乏對其他物質(zhì)的降解能力，所以需要通過微生物之間的協(xié)同作用，共同作用于底物，使底物得到更好的分解利用，從而得到較優(yōu)的發(fā)酵產(chǎn)品［15-17］。葉龍翔等用黑曲霉、酵母菌和木霉(1∶2∶1)混菌固體發(fā)酵硫苷的降解率最高達(dá)到89.49%。王曉凡等［18］用多菌復(fù)合固態(tài)發(fā)酵菜籽粕硫苷降解率達(dá)到91.36%，顯著提高了原料利用率。Khan［19］等利用混菌發(fā)酵，濾紙酶活(FPA)和葡聚糖內(nèi)切酶(CMC)酶活分別達(dá)到1.43 U/mL，2.40 U/mL，發(fā)酵第4天還原糖含量可達(dá)2.58 g/L，得到顯著提高。由于微生物本身機(jī)制的復(fù)雜性，微生物之間的共生狀態(tài)也是復(fù)雜的，并非所有的微生物之間都是互利共生的，所以要選取最佳的發(fā)酵方式，需要了解菌種之間的共生狀態(tài)，后進(jìn)行試驗研究。黑曲霉是公認(rèn)的代謝產(chǎn)物可直接用于食品工業(yè)的高產(chǎn)果膠酶菌株，而綠色木霉由于含有能夠同時降解殼聚糖和纖維素的雙功能酶［20-23］，也得到廣泛應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉和黑曲霉存在互惠共生關(guān)系，兩者可進(jìn)行混菌發(fā)酵對番茄廢渣進(jìn)行降解處理。

總糖的含量代表著發(fā)酵環(huán)境中菌種酶系1將原材料降解成大分子多糖及小分子糖的能力，總糖含量越多說明降解原材料的能力越強(qiáng)，本實驗結(jié)果表明黑曲霉發(fā)酵過程中所得總糖較綠色木霉多，且纖維素酶和果膠酶的測定結(jié)果也同樣地說明黑曲霉酶活較強(qiáng)，霉菌混均發(fā)酵實驗也顯示在在綠色木霉∶黑曲霉=1∶2的情況下原材料可得到較好的降解。且在發(fā)酵第2天時總糖含量最大，還原糖利用較少，是添加酵母菌的最佳時期。

實驗結(jié)果顯示，在只添加熱帶假絲酵母的情況下可得到較高蛋白質(zhì)含量的發(fā)酵產(chǎn)品，符合發(fā)酵目的及要求。實驗結(jié)果表明，選擇麩皮添加量為15%既可有效地進(jìn)發(fā)酵又確保了以番茄廢渣為主要原料，所以發(fā)酵原料即為15%麩皮和番茄廢渣。最佳菌種配比為:綠色木霉∶黑曲霉=1∶2，發(fā)酵48 h后添加熱帶加絲酵母，再發(fā)酵4 d收取發(fā)酵產(chǎn)品。此時發(fā)酵產(chǎn)品干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量高達(dá)35.00%，符合蛋白飼料的要求。

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