羊奶中表皮生長因子(EGF)變化規(guī)律研究*

云丹，張富新，于玲玲，劉穎沙，侯院林，雷飛艷

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710119)

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是美國生化學(xué)家Cohen［1-2］于1959年在用羧甲基纖維素純化小鼠頜下腺神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)時發(fā)現(xiàn)的一種小分子多肽，由53個AA殘基構(gòu)成，等電點(PI)為 4.6，相對分子質(zhì)量為 6 045Da［3］。后來人們發(fā)現(xiàn)，EGF廣泛分布于哺乳動物的循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和造血系統(tǒng)［4］，在尿液、胃液、唾液、膽汁、羊水及乳汁等組織液中含量較高［5］。大量研究表明，哺乳動物乳汁中EGF對后代的生長發(fā)育有重要影響，作為“胃腸道監(jiān)視肽”，可刺激整個腸道的DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，增加胃腸道重量，改善胃酸分泌及腸道酶活性水平，促進(jìn)新生動物對異體蛋白的消化吸收，催化腸上皮細(xì)胞對金屬離子的轉(zhuǎn)運和糖代謝，保護(hù)胃腸道黏膜，還可促進(jìn)胎兒器官發(fā)育和功能成熟［6-7］。目前有關(guān)乳中EGF在人乳中研究報道較多，且人乳EGF濃度遠(yuǎn)高于其他哺乳動物［8-10］，而對羊乳中EGF研究報道較少。羊乳是人類利用的主要乳源之一，不僅含有人體所需的基本營養(yǎng)成分，還含有大量的生物活性物質(zhì)，其中EGF作為羊乳中重要的生物活性物質(zhì)備受人們關(guān)注［11］。有研究表明羊乳的化學(xué)組成不穩(wěn)定，乳成分受品種［12］、擠奶間隔［13］、泌乳期［14］等因素的影響較大，其中的EGF濃度也會隨之變化。因此，本文對影響羊乳中EGF的因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

羊乳，選擇西北農(nóng)林科技大學(xué)羊場健康奶山羊的乳樣。采取人工擠奶方式取樣，采樣時棄去前3把奶，取擠奶中段的乳樣。采樣后立即將乳樣在-40℃下冷凍儲存。

試劑盒，山羊表皮生長因子酶聯(lián)免疫試劑盒，來自美國R＆D公司，最低檢測濃度為1.0 pg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

MDF-U5411型低溫冰箱，日本三洋電機(jī)有限公司;JND-50型培養(yǎng)箱，寧波江南儀器有限公司;TGL-16gR型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;Multiskan Go型全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司;KQ3200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;移液槍(100 ～1 000 μL，10 ～100 μL，0.5 ～10 μL)，德國 eppendorf公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ML104型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;GZX-9146 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LS-B型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 EGF濃度測定

1.3.1 樣品處理

樣品處理按照Oslislo［15］的方法并加以改進(jìn)。將冷凍的乳樣在4℃解凍后，用移液槍吸取1 mL乳樣置于2 mL離心管中，然后在5 000 g下低溫(4℃)離心10 min，去除上層乳脂，取上清液，用ELISA試劑盒測定EGF濃度。

1.3.2 EGF濃度的檢測

將EGF試劑盒從4℃的冰箱取出后室溫(20℃)平衡20 min，取出試劑盒中的板條。用移液槍取10 μL處理后的乳樣加入板條反應(yīng)孔中，再加樣本稀釋液40 μL，隨后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔后，在37℃保溫60 min。然后棄去反應(yīng)孔中液體，并在吸水紙上拍干，加入預(yù)先稀釋好的洗滌液(用蒸餾水按體積比1∶20稀釋)350 mL，靜置1 min，棄去洗滌液，在吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。在洗滌后的反應(yīng)孔中加入底物A、B各50 μL，37℃保溫15 min后加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的吸光度值。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將山羊表皮生長因子(EGF)酶聯(lián)免疫試劑盒中濃度為1 000 pg/mL的EGF標(biāo)準(zhǔn)品用試劑盒中的標(biāo)品稀釋液依次稀釋成濃度為 1 000、500、250、125、62.5、0 pg/mL的溶液。各取50 μL加入標(biāo)準(zhǔn)孔，按照1.3.2的方法檢測標(biāo)品在450 nm處的吸光度值，然后以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)(x)，對應(yīng)吸光度值作為縱坐標(biāo)(y)，繪制EGF標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程，按照線性回歸方程計算不同樣品中的EGF濃度。

1.4 數(shù)據(jù)的處理

所有數(shù)據(jù)均采用DPS軟件進(jìn)行處理，并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶山羊品種對乳中EGF濃度的影響

選擇泌乳中期的薩能羊、關(guān)中羊、努比羊、圭山羊各5只進(jìn)行采樣，并以牛乳為對照，測定其EGF濃度。結(jié)果如圖1所示。

圖1 奶山羊品種對乳中EGF濃度的影響Fig.1 Effects of goat breeds on the concentrations of EGF in goat milk

由圖1可以看出，羊奶中EGF濃度較高，顯著高于牛奶中的濃度(P＜0.05)。但不同品種奶山羊所產(chǎn)的羊奶中EGF濃度有較大的變化，其中關(guān)中羊所產(chǎn)的羊乳中 EGF濃度最高［(42.67±1.41)ng/mL)］，顯著高于其他品種(P＜0.05)，其次是薩能羊，而努比羊和圭山羊所產(chǎn)的羊奶中EGF濃度最低。關(guān)于不同奶山羊品種對乳中EGF的研究報道較少，Wu［16］比較了努比羊、莎能羊、阿爾卑斯羊、吐根堡羊、拉曼沙羊奶樣的生長因子活性，發(fā)現(xiàn)不同品種奶山羊乳中EGF濃度有較大差別，其中努比羊奶中生長因子活性最高。不同哺乳動物乳中EGF之間的差異主要與遺傳特性和飼養(yǎng)條件有關(guān)［17］，即使同一哺乳動物不同個體之間也存在一定的差異。

2.2 泌乳期對羊乳中EGF濃度的影響

選擇10只健康的關(guān)中奶山羊，分別于產(chǎn)羔后的第30，60，90，120，150，180，210d 采集乳樣，測定其EGF濃度。結(jié)果如圖2所示。

圖2 泌乳期羊乳中EGF濃度的影響Fig.2 Effects of lactation on the concentrations of EGF in goat milk

由圖2可以看出，不同泌乳期的羊乳中EGF濃度具有顯著性差異(P＜0.05)。分娩后30～90 d EGF濃度最高，顯著高于120～210 d乳樣中的濃度(P＜0.05)，其中以泌乳高峰期第90天的濃度為最高［(47.65±1.55)ng/mL)］，120～150 d明顯下降(P＜0.05)，在之后的180～210 d略有升高，但未高于泌乳高峰期。關(guān)于泌乳期對羊乳中EGF濃度的影響未見報道，但在人乳中已有報道，孫曉勉［18］對不同泌乳階段人乳中EGF濃度變化研究發(fā)現(xiàn)乳母乳汁中EGF濃度變化不大(P＞0.05)，這與本研究結(jié)果不一致，原因可能是羊乳與人乳泌乳期時間不同。有研究報道，處于泌乳期的奶山羊乳腺中的生長激素不僅可與催乳素共同誘導(dǎo)和維持泌乳，調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育和乳汁成分的變化［19］，而且能誘導(dǎo)乳腺導(dǎo)管產(chǎn)生EGF，從而泌乳期生長激素的改變可導(dǎo)致乳腺合成至乳中的EGF 濃度差別較大［20-21］。

2.3 擠奶間隔對羊乳中EGF濃度的影響

選擇10只泌乳中期的關(guān)中奶山羊，在早上7:30和下午19:30分別擠奶1次，作為擠奶間隔為12 h的乳樣。連續(xù)采樣2 d后，每天只在早上7:30擠奶1次作為擠奶間隔為24 h的乳樣，測定其EGF濃度。結(jié)果如圖3所示。

圖3 擠奶間隔對羊奶中EGF濃度的影響Fig.3 Effects of milking intervals on the concentrations of EGF in goat milk

由圖3可以看出，12 h和24 h擠奶間隔對關(guān)中羊乳中 EGF濃度無顯著性影響(P＞0.05)。Wu等［16］對15只努比奶山羊12 h和24 h擠奶間隔乳樣中生長因子活性的檢測發(fā)現(xiàn)，擠奶間隔對乳中生長因子無顯著性影響(P＞0.05)，這與本研究的結(jié)果一致。Stelwagen［22］報道了乳汁在持續(xù)累計21 h后，奶山羊乳腺腺泡上皮細(xì)胞的緊密連接開始被打斷，血清中的生長因子則以過濾的方式擴(kuò)散至乳中，然而Dehnhard［23］報道了山羊奶EGF在血清中的含量比乳中的低，因此可以推測羊乳中EGF濃度的變化不僅僅是由于乳腺腺泡上皮細(xì)胞的緊密連接被打破的結(jié)果。而本研究通過對擠奶間隔的研究表明，山羊奶EGF濃度在24 h擠奶間隔條件下并無明顯增加，由此可以看出，24 h擠奶間隔不能升高羊奶中的EGF濃度，此方法不能作為提高乳中EGF濃度的途徑。但是曹秀蓮［24］研究發(fā)現(xiàn)，增加擠奶次數(shù)可提高羊奶日泌乳量，因此選擇12 h擠奶間隔的乳樣。

2.4 泌乳量對羊奶中EGF濃度的影響

選擇日泌乳量分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 kg的關(guān)中奶山羊各5只采集乳樣，測定EGF濃度。結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，隨著日泌乳量的增加，羊奶中EGF濃度呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，當(dāng)日泌乳量為1.0 kg時，乳中EGF濃度最高，且顯著高于其他泌乳量的乳樣(P＜0.05);當(dāng)日泌乳量大于2.5 kg時，乳中EGF濃度逐漸下降，日泌乳量為2.0～3.0 kg時，EGF濃度趨于穩(wěn)定(P＞0.05)。由此可見，乳中EGF濃度受泌乳量的影響較大，日泌乳量越小，乳中EGF濃度越高。泌乳量對羊乳中EGF濃度影響未見報道，但泌乳量對牛奶成分的影響已有報道，吳海濤等［25］對泌乳量對牛奶中的脂肪影響研究表明，隨著泌乳量的增大，牛奶中脂肪含量有所降低，而 Brown等［26］認(rèn)為，乳腺細(xì)胞合成分泌EGF主要是通過合成為乳脂肪膜結(jié)合性EGF，然后釋放至乳中，由此可推測泌乳量較低時，乳中脂肪含量較高，從而導(dǎo)致分泌至乳中的EGF濃度也會增加。

圖4 日泌乳量對羊奶中EGF濃度的影響Fig.4 Effects of milk yields on the concentrations of EGF in goat milk

2.5 胎次對山羊奶EGF濃度的影響

選擇產(chǎn)羔第1～7胎的關(guān)中奶山羊，在泌乳中期采集乳樣。測定其EGF濃度。結(jié)果如圖5所示。

圖5 胎次對山羊奶EGF濃度的影響Fig.5 Effects of goat parity on the concentrations of EGF in goat milk

由圖5可以看出，奶山羊產(chǎn)羔第1胎的乳中EGF濃度較低(P＜0.05)，產(chǎn)羔2～5胎時，羊乳中EGF濃度顯著增大(P＜0.05)，其中產(chǎn)羔第5胎時，羊乳中的EGF濃度達(dá)到最高［(43.40±1.75)ng/mL)］，但在產(chǎn)羔第5胎以后，羊乳中的EGF濃度逐漸降低(P＜0.05)。乳中的EGF主要是由乳腺細(xì)胞合成分泌［27］，乳腺細(xì)胞的發(fā)育程度與乳營養(yǎng)成分的合成分泌密切相關(guān)［28，29］，奶山羊第 1胎產(chǎn)羔后乳腺細(xì)胞發(fā)育不完全;在第2胎產(chǎn)羔后，乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育趨于成熟，合成分泌生物活性物質(zhì)的能力也有所提高，釋放至乳中的EGF也有明顯的增加;但在奶山羊產(chǎn)羔第5胎之后，其乳腺上皮細(xì)胞逐漸衰老退化，分泌合成乳成分的能力降低，導(dǎo)致EGF濃度降低。

3 結(jié)論

通過對羊奶中EGF濃度變化規(guī)律研究表明，發(fā)現(xiàn)關(guān)中奶山羊所產(chǎn)羊乳中EGF濃度最高;對于不同泌乳期的羊乳，30～90 d時EGF濃度較高;擠奶間隔對乳中EGF濃度無顯著性影響;奶山羊日泌乳量越小，乳中EGF濃度越高;產(chǎn)羔后2～5胎的羊乳中EGF濃度較高。因此，在開發(fā)富含EGF的功能性羊奶產(chǎn)品時，可收集泌乳期為30～90 d，擠奶間隔為12 h，日泌乳量小，2～5胎的關(guān)中奶山羊乳樣。

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