糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑的篩選及加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究

李衛(wèi)娟，王計(jì)偉，王宇霄，劉春雪，洪平

(安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司，江蘇 太倉(cāng)，215437)

糞腸球菌是從動(dòng)物腸道里分離出來(lái)的一種具有良好生物安全性及益生特性的腸道益生菌，可直接參與宿主的物質(zhì)代謝。其生長(zhǎng)速度快，每19 min分裂1次，代謝過(guò)程中會(huì)分泌L-型乳酸、腸球菌素等非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，并產(chǎn)生多種對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有利的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［1-2］，因而常作為微生物飼料添加劑來(lái)增強(qiáng)動(dòng)物腸道健康。然而其耐熱穩(wěn)定性較差，經(jīng)飼料高溫制粒及貯藏后，活菌數(shù)大大下降。一般來(lái)講，飼料中益生菌的數(shù)量應(yīng)在106/g以上才能使其順利到達(dá)腸道并發(fā)揮作用［3］，因此需要對(duì)提高糞腸球菌耐熱穩(wěn)定性的技術(shù)進(jìn)行研究。

目前國(guó)內(nèi)外在提高益生菌熱穩(wěn)定性方面已開(kāi)展了大量的研究，主要包括菌種誘變、基因改造、微膠囊、保護(hù)劑等技術(shù)。關(guān)于保護(hù)劑方面的研究多集中于液態(tài)發(fā)酵的益生菌，關(guān)于固態(tài)發(fā)酵的益生菌保護(hù)劑的研究則相對(duì)較少。采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的益生菌在穩(wěn)定性方面通常較液態(tài)發(fā)酵的益生菌要好，一方面固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)可作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，另一方面可作為包埋基質(zhì)對(duì)菌體進(jìn)行包埋保護(hù)［4］。為了驗(yàn)證保護(hù)劑的保護(hù)效果，最可靠的方法是常溫貯藏。但歷時(shí)較長(zhǎng)，為了快速獲得結(jié)果，常采用加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)。加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)常用于預(yù)測(cè)凍干的動(dòng)植物病毒及不同的微生物儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，以便在短時(shí)間內(nèi)獲得儲(chǔ)藏?cái)?shù)據(jù)［5-6］

本研究在固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上優(yōu)化糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑配方，并通過(guò)加速儲(chǔ)存試驗(yàn)，建立儲(chǔ)存穩(wěn)定性方程來(lái)預(yù)測(cè)其儲(chǔ)存壽命，為工業(yè)化生產(chǎn)中該產(chǎn)品有效活菌數(shù)的快速預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糞腸球菌(Enterococcus faecalis):中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

海藻糖為食品級(jí)，美國(guó)RSG公司;抗壞血酸鈉、甘油為分析純;脫脂奶粉，伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，檸檬酸氫二銨2.0，葡萄糖20.0，乙酸鈉5.0，K2HPO42.0，MgSO40.58，MnSO40.25，蒸餾水1 L，加入吐溫80 1.0 mL，pH 6.26，121 ℃滅菌15 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/kg):麥麩940，豆粕40，玉米粉20，121℃滅菌30 min。

營(yíng)養(yǎng)液(g/kg固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基):酵母膏2.5，蛋白胨 5.0，葡萄糖 10.0，牛肉膏 3.0，MgSO40.5，K2HPO40.5，500 mL自來(lái)水溶解，121℃滅菌15 min。

檢測(cè)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏5，葡萄糖20，NaCl 5，瓊脂粉15，pH 6.5，121 ℃滅菌 15 min。

1.2 糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑的篩選

1.2.1 糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品制備

將活化后的種子液以10%的接種量與營(yíng)養(yǎng)液一起接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后于37℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 保護(hù)劑的優(yōu)化

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)資料［7-12］，選用甘油、海藻糖、脫脂奶粉、抗壞血酸鈉作為保護(hù)劑的成分，采用正交試驗(yàn)對(duì)保護(hù)劑的配比進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。將各組成分以少許等量無(wú)菌水溶解后，分別與發(fā)酵完畢的糞腸球菌樣品混勻，40℃烘干收集。

表1 保護(hù)劑篩選正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The orthogonal experimental design for protectants screen

1.2.3 耐熱型復(fù)合保護(hù)劑保護(hù)效果評(píng)價(jià)

采用人工耐熱性試驗(yàn)對(duì)上述各試驗(yàn)組保護(hù)劑的保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)定方法:將含有225 mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶置于60℃水浴鍋中預(yù)熱20～30 min，使瓶?jī)?nèi)溫度與水浴鍋溫度一致，分別稱取25 g樣品加至相應(yīng)的三角瓶中，處理5 min后迅速冰浴冷卻，20℃ 200 r/min 0.5 h后通過(guò)梯度稀釋法測(cè)定活菌數(shù)。以未經(jīng)水浴處理的作為對(duì)照組。

1.3 糞腸球菌加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)

將加入最佳保護(hù)劑配方的糞腸球菌樣品置于不同溫度下儲(chǔ)存，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表2)中的時(shí)間取樣測(cè)定活菌數(shù)。

表2 加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)分組Table 2 The experimental design for the accelerated storage test

以40、50、60℃下樣品的殘余菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，放置時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到該糞腸球菌樣品的模擬一級(jí)熱降解圖，由此得到對(duì)應(yīng)溫度下樣品的熱降解速率K。以熱降解速度K的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，溫度(絕對(duì)溫度)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得到一元線性回歸方程，繼而推算出某一溫度下的熱降解速率常數(shù)，結(jié)合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo)出該溫度下貯存一段時(shí)間后的殘余菌數(shù)。為驗(yàn)證方程的有效性，將添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品于25℃貯藏，分別于15、30、45天取樣測(cè)定活菌數(shù)以驗(yàn)證方程的有效性。

2 結(jié)果與討論

2.1 糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑的篩選

本研究選用脫脂奶粉、海藻糖、甘油、抗壞血酸鈉4種保護(hù)劑，根據(jù)參考文獻(xiàn)常見(jiàn)添加水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，各因素對(duì)糞腸球菌穩(wěn)定性的影響水平大小為:脫脂奶粉＞抗壞血酸鈉＞海藻糖＞甘油，最佳組合為A1B2C2D2，即抗壞血酸鈉 10 g/kg、海藻糖 30 g/kg、甘油 40 g/kg、脫脂奶粉80 g/kg。經(jīng)驗(yàn)證，60℃水浴處理5 min后平均存活率為75%(3個(gè)平行存活率分別為71%，76.74%，78%)，與未添加保護(hù)劑的對(duì)照組(3個(gè)平行存活率分別為51.92%，49%，46.29%)相比差異極顯著(P=0.000 6＜0.01)。

表3 糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑篩選正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal experiment for protectants screen of E.faecalis

目前可作為微生物保護(hù)劑的物質(zhì)通常包括脫脂奶粉、明膠、蔗糖、海藻糖、甘油、谷氨酸鈉等。研究表明，脫脂奶粉中的乳清蛋白尤其是酪蛋白在干燥時(shí)，可以在菌體表面形成一層蛋白膜，對(duì)細(xì)胞加以保護(hù)。而抗壞血酸鈉則作為水溶性強(qiáng)抗氧化劑，減少菌體在干燥或貯存過(guò)程中環(huán)境中氧氣對(duì)菌體的影響［13］。甘油作為一種可滲透至細(xì)胞內(nèi)部的保護(hù)劑，通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，從而減輕細(xì)胞由于溫度升高引起的細(xì)胞損傷。在多種保護(hù)劑的共同作用下，菌體在干燥及保存過(guò)程中受外界不良環(huán)境的影響降低。孫盈等人對(duì)混合乳酸菌的最佳耐熱凍干保護(hù)劑進(jìn)行了研究，確定其最佳凍干保護(hù)劑配方為脫脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮5%、海藻糖5%、VC0.5%，凍干存活率預(yù)測(cè)值可達(dá)93.05%［9］。

2.2 糞腸球菌加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)

低溫留樣觀察是測(cè)定產(chǎn)品儲(chǔ)存穩(wěn)定性的一種重要方法，但儲(chǔ)存時(shí)間往往較長(zhǎng)，可通過(guò)加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)來(lái)對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。按照1.3中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以儲(chǔ)存一段時(shí)間后的菌數(shù)N的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，儲(chǔ)存時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品在40，50，60℃的熱降解速度 K分別為-0.002，-0.009，-0.061。

圖1 糞腸球菌殘余菌數(shù)與貯藏溫度和時(shí)間的關(guān)系圖Fig.1 Graphic correlation between survival of E.faecalis and the time at different temperature

以添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品在40，50，60℃的熱降解速度K的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，溫度(絕對(duì)溫度)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖(見(jiàn)圖2)，得到一元線性回歸方程:lgK=-7 730/T+21.95，通過(guò)該方程可計(jì)算出25℃下糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品的熱降解速率常數(shù)為-1.06×10-4，4℃熱降解速率常數(shù)為-1.15×10-6。張英華等［12］對(duì)加入冷凍干燥保護(hù)劑的乳酸菌進(jìn)行了加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究，通過(guò)方程推導(dǎo)出4℃的熱降解速率為-1.656×10-4，本研究中糞腸球菌4℃的熱降解速率約為其1/100，具有更好的熱穩(wěn)定性。

圖2 糞腸球菌熱降解速率與溫度的關(guān)系圖Fig.2 The correlation between the thermal degradation rate and temperature of Enterococcus faecalis

為驗(yàn)證方程的有效性，將添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品于25℃分別貯存15，30，45 d并測(cè)定殘余活菌數(shù)，與預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，貯存15，30天的實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果極為接近，精確率接近100%，貯存45天的實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果相比，精確率達(dá)到為90.6%，因此可用該方程來(lái)預(yù)測(cè)某一溫度下儲(chǔ)藏一定時(shí)間之后樣品的殘余菌數(shù)。

表4 25℃下儲(chǔ)存穩(wěn)定性方程有效性驗(yàn)證結(jié)果Table 4 The results of validity verification for the storage stability equation at 25℃

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，確定糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑配方為:抗壞血酸鈉10 g/kg、海藻糖30 g/kg、甘油40 g/kg、脫脂奶粉80 g/kg。加入該保護(hù)劑的糞腸球菌樣品經(jīng)60℃處理5 min后平均存活率為75%，與未添加保護(hù)劑的對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01)。分別于40，50，60℃對(duì)添加保護(hù)劑的糞腸球菌樣品進(jìn)行加速儲(chǔ)存試驗(yàn)，并建立了儲(chǔ)存穩(wěn)定性方程:lgK=-7 730/T+21.95，根據(jù)該方程可知糞腸球菌25℃熱降解速率為-1.06×10-4。將樣品于25℃分別貯存15，30，45 d，測(cè)定殘余活菌數(shù)，并與預(yù)測(cè)理論值比較，接近程度在90%以上，驗(yàn)證了方程的有效性。

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