解脂亞羅酵母赤蘚糖醇發(fā)酵過程的研究*

裴疆森，黃玲，張露，田淑斌

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)2(山東淄博中食歌瑞生物技術(shù)有限公司，山東 淄博，255120)

赤蘚糖醇是一種天然的多元醇類甜味劑，甜味純正，熱量值接近零，為食品和保健品業(yè)者所關(guān)注。赤蘚糖醇生產(chǎn)菌多來源于自然界分離的耐高滲酵母，如球擬酵母屬(Torulopsis)，假絲酵母屬(Candida)，絲孢酵母Trichosporonoides，畢赤酵母屬(Pichia)，三角酵母屬(Trigonopsis)等。此外還有類酵母真菌Monilliella，短柄霉Aureobasidium sp.等。這些菌株可以利用多種底物產(chǎn)生赤蘚糖醇，球擬酵母屬和漢遜酵母屬的酵母以烷烴作為碳源生產(chǎn)赤蘚糖醇，本文通過從篩選國內(nèi)菌種保藏機構(gòu)保藏的和從自然界分離得到的酵母菌進(jìn)行赤蘚糖醇的發(fā)酵試驗，期望獲得發(fā)酵性能更優(yōu)良的菌種，并開發(fā)適合以葡萄糖為原料的赤蘚糖醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝路線。

1 材料與方法

1.1 菌株

使用的酵母菌株購自中國普通微生物保藏中心(CGMCC)和中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC);自然來源的酵母菌分離自樹脂、水果、蜂蜜等來源。

1.2 培養(yǎng)基

酵母分離培養(yǎng)基(YPD)的組成為400 g/L葡萄糖、6 g/L酵母浸出物、10 g/L聚胨的液體培養(yǎng)基;發(fā)酵種子培養(yǎng)基的組成為200 g/L葡萄糖、15 g/L酵母浸出物的液體培養(yǎng)基;赤蘚糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基(YDS)的組成為300～400 g/L葡萄糖，5g/L酵母浸出物，5 g/L檸檬酸銨，1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O 的液體培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均以自來水配制，滅菌條件為115 ℃，20 min。

1.3 分析方法

赤蘚糖醇、葡萄糖采用高效液相色譜法分析。色譜儀:島津LC-20AD;柱子:Benson BP-100H+碳水化合物柱;流動相:重蒸水，流速:0.8 mL/min;柱溫:80℃;檢測器:RID-10A示差檢測器;進(jìn)樣器:島津SIL-20A 自動進(jìn)樣器，進(jìn)樣量:20 μL。

1.4 酵母菌種鑒定方法

酵母的生理生化鑒定方法按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行［1］;酵母的26S rDNA的D1/D2序列分析方法中的序列PCR擴增的引物設(shè)計NL1:5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ’，NL4:5 ’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，由上海生工合成;PCR擴增條件參照文獻(xiàn)進(jìn)行［2］，擴增產(chǎn)物由諾賽公司測序，序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析利用MEGA軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源酵母菌株的赤蘚糖醇發(fā)酵能力比較

對不同來源的耐滲酵母菌，進(jìn)行了對比搖瓶發(fā)酵試驗，經(jīng)過HPLC方法分析，其結(jié)果見表1。

表1 不同來源的酵母菌種的赤蘚糖醇發(fā)酵能力比較Table 1 Erythritol production of yeasts from different sources

從搖瓶發(fā)酵結(jié)果可知，不同的菌種在高糖條件下的糖醇生產(chǎn)能力存在很大的差異，多數(shù)酵母菌會積累一定量的小分子的糖醇物質(zhì)，但赤蘚糖醇的產(chǎn)量普遍不高，只有1株從柑橘中分離得到的編號為Y-22的酵母具有較高的赤蘚糖醇產(chǎn)量(見圖1)，而且甘油和核糖醇等雜質(zhì)糖醇的產(chǎn)量很少。

圖1 從柑橘中分離得到的酵母Y-22的發(fā)酵液的HPLC圖譜Fig.1 HPLC diagram of the fermentation liquid with yeast Y-22 isolated from citrus fruit

2.2 Y-22酵母菌種的鑒定

由于赤蘚糖醇的主要用途為食用甜味劑，因此有必要對其生產(chǎn)菌種Y-22的分類地位和安全性進(jìn)行研究和考察。

2.2.1 生理生化鑒定

對酵母Y-22進(jìn)行常規(guī)的生理生化鑒定，其一般的培養(yǎng)特征為:

麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng):25℃下培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞卵形或橢圓形，細(xì)胞大小(2～5.5)μm×(3.5～15)μm，有菌膜形成。

麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng):25℃下培養(yǎng)1個月后，菌落奶油酪狀，乳白色至灰白色，表面皺褶，邊緣波浪狀。

玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng):有假菌絲和真菌絲產(chǎn)生。

Y-22的生化實驗表明該酵母對所有的碳源均不發(fā)酵，而對不同碳源利用性質(zhì)見表2。

表2 酵母Y-22的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of yeast Y-22

其他生化特性為:裂解熊果苷，-;類淀粉物質(zhì)的產(chǎn)生，-;同化硝酸鹽，-;尿素酶活性，+;無維生素培養(yǎng)基生長，-;37℃下生長，-(+表示該性質(zhì)為陽性;-表示該性質(zhì)為陰性)。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

利用引物對酵母菌Y-22的基因組進(jìn)行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，堿基序列為:

GCTCAAATTTGAAACCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCGGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGCGCCTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACCCATTTCACCCGTCTTG

經(jīng)過序列比對和26S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，Y-22酵母菌株與已經(jīng)發(fā)表的解脂亞羅酵母的同源性達(dá)到100%(見圖2)。

圖2 基于Y-22的26S rDNA序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 26S rDNA Y-22 sequence analysis

綜合生理生化鑒定結(jié)果，可以確定酵母Y-22為1 株解脂亞羅酵母 Yarrowia lipolytica［3］。

2.3 Y-22菌種的生長和發(fā)酵條件

在YPD和添加無機鹽的YDS等不同培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)Y-22酵母時，兩者的生長情況差別不大(見表3)。在低糖情況下對數(shù)生長期為約10h，細(xì)胞倍增時間為約2h。Y-22在YDP固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，菌落呈乳白色，表面光滑，邊緣光滑;延長培養(yǎng)后菌落表面產(chǎn)生褶皺。Y-22在無氧條件下不生長，在低糖的液體培養(yǎng)基中細(xì)胞呈多邊生長的橢圓形;在高糖培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中葡萄糖濃度大于250 g/L以上)，細(xì)胞基本呈圓形(見圖3)，細(xì)胞的倍增時間也延長到4 h，說明滲透壓對于細(xì)胞形態(tài)和生長均具有一定的影響。

表3 酵母Y.lipolytica Y-22的搖瓶生長過程(30℃，200 r/min)Table 3 Growth of Y.lipolytica Y-22 in liquid media

圖3 Y-22的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Micro-morphology of yeast L.lipolytica Y-22

由于赤蘚糖醇是還原性的代謝產(chǎn)物，相關(guān)的氧化還原酶涉及到多種金屬離子的輔助因子。根據(jù)文獻(xiàn)報道［4］，對于酵母 C.magnoliae的赤蘚糖醇發(fā)酵過程，使用微量的Cu2+可以提高糖醇的產(chǎn)量，對于酵母L.lipolytica Y-22的代謝過程，不同的微量元素對糖醇產(chǎn)量的影響見表4。

表4 微量元素對赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of trace elements on Y-22 erythritol fermentation

結(jié)果表明除了Cu2+對赤蘚糖醇的積累有利，Co2+和Fe2+對赤蘚糖醇不利外，其他的元素在此濃度下對赤蘚糖醇的積累影響不顯著。

2.4 解脂亞羅酵母Y-22的赤蘚糖醇發(fā)酵過程的放大和控制

在搖瓶發(fā)酵試驗的基礎(chǔ)上，還進(jìn)行了更大規(guī)模的赤蘚糖醇發(fā)酵試驗。圖4是在5 m3的發(fā)酵罐中的赤蘚糖醇發(fā)酵過程。在30℃下，利用含325g/L的葡萄糖YDS培養(yǎng)基發(fā)酵，赤蘚糖醇的生產(chǎn)強度可以達(dá)到1.17 g/(L·h)。最高糖醇濃度為15.4 g/100 mL，最高轉(zhuǎn)化率為47%，發(fā)酵時間為132 h。

圖4 5m3發(fā)酵罐赤蘚糖醇發(fā)酵試驗Fig.4 Erythritol fermentation process in a 5m3fermentor

為了減少價格昂貴的酵母浸粉的用量，進(jìn)行了用45g/L的玉米漿(50%固形物含量)替代YDS培養(yǎng)基中的酵母浸出物為培養(yǎng)基的赤蘚糖醇發(fā)酵試驗。初始葡萄糖為336.7 g/L的發(fā)酵過程中，可以產(chǎn)生赤蘚糖醇153 g/L，轉(zhuǎn)化率為47%，生產(chǎn)強度可達(dá)1.6 g/(L·h)(見圖5)。但此發(fā)酵過程中由于玉米漿的使用會造成大量難以控制的泡沫，而且造成玉米漿中的不溶性殘渣較多，對后提取帶來較大的影響。加之玉米漿的質(zhì)量不夠穩(wěn)定，遂在以后更大規(guī)模的發(fā)酵試驗中仍然使用YDS培養(yǎng)基進(jìn)行Y-22的赤蘚糖醇發(fā)酵。

圖5 5m3上利用玉米漿為氮源進(jìn)行的赤蘚糖醇發(fā)酵過程Fig.5 Erythritol fermentation process with CSL substitution for YE medium

赤蘚糖醇的發(fā)酵是一個嚴(yán)格好氧過程，通過改變攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量，對發(fā)酵過程的溶解氧進(jìn)行控制，能夠顯著提高發(fā)酵的速率，圖7是將DO2控制在約40%的赤蘚糖醇發(fā)酵過程。當(dāng)初始葡萄糖為336 g/L，最高赤蘚糖醇含量為154.7 g/L，發(fā)酵時間為116 h，生產(chǎn)強度從對照的1.17 g/(L·h)提高到了1.33 g/(L·h)。

由于酵母細(xì)胞在高滲環(huán)境中的生長和發(fā)酵都受到一定的抑制，為了縮短赤蘚糖醇的發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)效率，在發(fā)酵過程中嘗試采用葡萄糖分批流加的發(fā)酵方式，即降低起始葡萄糖，然后中途不斷補加高濃葡萄糖以提高產(chǎn)物的積累。試驗發(fā)現(xiàn)由于起始葡萄糖濃度的適當(dāng)降低，葡萄糖在前期的消耗速率達(dá)到了5.5 g/(L·h)，赤蘚糖醇的積累速率也達(dá)到了1.76 g/(L·h);在后期的流加階段，葡萄糖的消耗速率達(dá)到了2.5 g/(L·h)，而赤蘚糖醇的積累速率為1.5 g/(L·h)，前期和后期的轉(zhuǎn)化率差別很大，分別為32%和63%(圖7)。故為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化率的同步提高，還需要對流加策略進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖6 50 m3罐溶解氧控制條件下的赤蘚糖醇發(fā)酵過程Fig.6 Erythritol fermentation process in 50 m3 fermentor with controlled DO level

圖7 葡萄糖流加過程對赤蘚糖醇發(fā)酵的影響Fig.7 Fed-batch erythritol fermentation process

3 討論

赤蘚糖醇是酵母通過HMP途徑產(chǎn)生的一種小分子多元醇，用以平衡胞外的高滲透壓環(huán)境，其大致的代謝過程如圖8所示，6-磷酸葡萄糖經(jīng)過6-磷酸葡萄糖脫氫酶(ZWF1)作用生成6-磷酸葡萄糖酸，進(jìn)入HMP途徑。再經(jīng)過轉(zhuǎn)酮基酶(TKL)和轉(zhuǎn)醛基酶(TAL)的作用得到4-磷酸赤蘚糖，再經(jīng)過去磷酸化和赤蘚糖還原酶(ER)的作用產(chǎn)生赤蘚糖醇。

赤蘚糖醇是一種4碳糖醇，可能由于從6碳糖合成的分子得率比合成3碳的甘油要低，故在耐高滲酵母中產(chǎn)赤蘚糖醇的菌種遠(yuǎn)比產(chǎn)甘油的少［5］，高產(chǎn)的菌株則更少。從天然來源分離得到的酵母菌Y-22經(jīng)過生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定為一株解脂亞羅酵母，這與可以利用正構(gòu)烷烴合成赤蘚糖醇的菌種屬于同一種［6］。

解脂亞羅酵母是在自然界很常見的一種非致病性酵母菌種，常見于奶酪［7-8］等發(fā)酵食品中。由于解脂亞羅酵母是一種專性好氧的非發(fā)酵性酵母菌種，故發(fā)酵過程中不產(chǎn)生乙醇等酵解副產(chǎn)物，對進(jìn)一步提高發(fā)酵過程的糖醇轉(zhuǎn)化效率有利。解脂亞羅酵母Y-22的赤蘚糖醇可以葡萄糖為碳源，在好氧的條件下高效產(chǎn)生赤蘚糖醇。發(fā)酵過程明顯分為對數(shù)生長段和后期穩(wěn)定段。在對數(shù)生長段，細(xì)胞生長旺盛，氧氣消耗很快，而糖醇只是在該階段的后期才開始積累。在后期穩(wěn)定段，細(xì)胞生長和氧氣消耗均趨于平緩，而葡萄糖的消耗和赤蘚糖醇的積累卻延續(xù)對數(shù)生長期后段的趨勢，這說明赤蘚糖醇的發(fā)酵過程是非生長偶聯(lián)的代謝過程。

在赤蘚糖醇發(fā)酵過程控制方面，氮源的種類對Y-22菌種的發(fā)酵性狀有一定的影響，控制溶解氧的水平對于維持發(fā)酵速度有很大的幫助，溶解氧控制在10% ～40%對發(fā)酵有利。在不同規(guī)模發(fā)酵水平上，解脂亞羅酵母Y-22的發(fā)酵轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到約50%。通過圖8對酵母的赤蘚糖醇發(fā)酵過程進(jìn)行化學(xué)計量和輔酶平衡方面的分析，在理想狀況下，酵母細(xì)胞利用葡萄糖合成赤蘚糖醇為唯一產(chǎn)物時的赤蘚糖醇的理論分子收率可達(dá)到1∶1.33，相當(dāng)于90%質(zhì)量轉(zhuǎn)化率。而實際上，由于磷酸戊糖途徑的其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生及C3化合物進(jìn)入TCA循環(huán)被氧化為CO2造成碳損失，赤蘚糖醇的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于理論最大值，這為進(jìn)一步通過代謝工程改造提高赤蘚糖醇的轉(zhuǎn)化率提出了目標(biāo)。

圖8 酵母合成赤蘚糖醇的代謝途徑Fig.8 Metabolic pathway of erythritol bio-synthesis in yeast cells

本文從自然界分離得到的Y-22酵母菌在小試和大規(guī)模發(fā)酵過程中均表現(xiàn)出良好的赤蘚糖醇發(fā)酵性能，具備相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值。

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