應用FRAP技術研究高蛋白中間水分食品體系中的分子遷移*

賈曉戈，李娟，陸乃彥，張軒，周鵬

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室;江南大學食品安全與營養協同創新中心，江蘇無錫，214122)

高蛋白中間水分食品通常是指一類蛋白質含量在20% ～50%之間、水分含量在10% ～25%之間、水分活度在0.5～0.8之間的食品［1］。高蛋白中間水分食品以及豐富的營養和良好的功能性，被廣泛應用于軍事、航空、運動營養等食品領域。但是，這類食品在貯藏過程中極易出現質地硬化的現象，嚴重降低了產品的食用品質且縮短了產品的貨架期。由于高蛋白中間水分食品富含蛋白質、碳水化合物和脂肪等物質，因此其在貯藏過程中發生質地硬化是一個涉及多種物理、化學變化的復雜過程，且在短期和長期貯藏過程中由不同因素所主導。近年來，一些研究者已經對引起高蛋白中間水分食品體系硬化的原因提出了多種假說，主要包括糖結晶［2-3］假說、蛋白質聚集［4-6］假說以及水分遷移［7-10］假說等。但是，這些假說存在一定的局限性和不確定性。

熒光漂白恢復技術(FRAP)是通過采用激光共聚焦掃描顯微鏡的高強度脈沖式激光照射生物體(如細胞)的某一區域，使得該區域的熒光分子淬滅。再利用低強度的激光進行掃描，來檢測該區域周圍非淬滅熒光分子向熒光漂白區域的擴散過程。該技術利用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質耦聯，用于檢測所標記分子在活體細胞表面或細胞內部運動及其遷移速率，已成為一種研究諸如活細胞、生物膜和其它生物環境體系中分子動力學的重要技術。近幾年來，FRAP技術結合激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)逐漸被廣泛應用于檢測食品體系中溶質分子的運動及其遷移情況［11-12］。

本研究通過采用FRAP技術，對高蛋白中間水分食品模擬體系在貯藏初期分子遷移運動情況進行監測分析，進而從分子水平輔助揭示造成高蛋白中間水分食品質地硬化的內在機理原因。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

酪蛋白酸鈉(NaCN，87%干基)，新西蘭恒天然集團;牛奶分離蛋白(MPC85，85%干基)，新西蘭恒天然集團;FITC熒光染料，美國Sigma公司;甘油、山梨醇、丙酮，國藥集團化學試劑有限公司;玻底培養皿，杭州生友生物技術有限公司;封口膜，美國Plechiney Plastic Packaging公司;其他試劑:國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

LSM-780激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司;Hitachi SEM-3030電子掃描顯微鏡，日本Hitachi公司;水分活度儀，德國Novasina AG公司;SHP-250生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高蛋白中間水分食品模型體系的制備

選取高蛋白營養棒(high-protein nutritional bar，一種典型的高蛋白食品體系)中常用的2種乳蛋白:酪蛋白酸鈉和濃縮乳蛋白，并根據表1中的配方制備高蛋白中間水分食品模型體系。具體的實驗步驟為:將2.5 g山梨醇溶解于1.25 g超純水中，再加入1.75 g甘油進行攪拌。攪拌均勻后，使其混合物與4.6 g乳蛋白粉混合2 min，揉制成均勻的面團，并用封口膜密封，以防止水分蒸發，然后裝進盛有Mg(NO3)2過飽和溶液的(aw=0.53)的密閉容器以待測定。將該密閉容器在室溫下平衡0.5 h后，進行第0天的取樣。取樣結束后，重新封口并放入密閉容器中置于25℃下儲藏。此后分別于第0、1、3、7天進行取樣。

表1 含不同乳蛋白的高蛋白中間水分食品模型體系配方Table 1 The model of high protein-intermediate moisture food blended with different milk proteins

1.3.2 熒光漂白恢復測定

1.3.2.1 樣品染色

具體實驗操作步驟為:首先配制0.2 mg/mL的異硫氰酸熒光素(FITC)/丙酮染色液。染色時，滴加6 μL該染色液于0.5 g的樣品中，混合均勻后，將0.3 g樣品轉移至玻底培養皿中，蓋上蓋玻片，并用AB膠封邊，并置于25℃下避光儲存0、1、3、7 d。

1.3.2.2 測定

觀測樣品的熒光漂白恢復時，將染色好的樣品置于激光共聚焦掃描顯微鏡的載物臺上，設定激發波長為488 nm，發射波長為510 nm，并在20倍目鏡下觀察樣品。在觀測視野區域內選擇邊長為18 μm的正方形區域作為漂白范圍，激光強度為100%。選取與漂白區域相鄰的與初始熒光值相等的區域用于背景校正。當視野FITC-蛋白體系被漂白瞬間，記錄時間為t=0。再次監測漂白區域FITC-蛋白體系的熒光恢復情況，每隔一段時間記錄熒光恢復情況圖像并進行圖像采集。

1.3.2.3 實驗數據處理

根據FRAP實驗結果，按公式1計算樣品的熒光恢復率(Kt):

式中:Iu，相鄰未漂白區域在t時間的熒光強度;Ib，漂白區域在t時間的熒光強度;Ib0，t=0時的熒光強度;Kt，在t時間樣品的恢復率。

所得實驗數據采用t檢驗法，當P＜0.05為差異顯著。

1.3.3 電子掃描顯微鏡(SEM)觀察微觀結構

量取20 mL 25%戊二醛溶液，并用pH=7.4的磷酸緩沖液(PBS)定容至200 mL，制成濃度為2.5%的戊二醛固定液。將模擬體系樣品制成0.03～0.1 g的片狀或條狀，并立即投入到50 mL的戊二醛固定液中(保證固定液完全浸沒樣品)4℃下固定24 h。適當搖晃固定液瓶，防止樣品粘著瓶底。固定完成后，從固定液中取出樣品，用超純水反復沖洗3次。隨后將沖洗后的樣品投入至體積分數50%的乙醇溶液(50 mL)中進行脫水。之后逐漸增加乙醇濃度，脫水梯度為50%-70%-80%-90%-100%-100%，每階段脫水30 min。再將樣品從無水乙醇中取出，自然晾干(3～6 h)。最后，將樣品進行表面噴金后，在電壓5 kV下進行100倍的電鏡觀察。

2 結果與討論

2.1 酪蛋白酸鈉模型體系熒光漂白恢復結果

圖1為新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系(貯藏第0天)的FRAP結果圖。

由圖1可見，酪蛋白酸鈉模型體系中大部分的酪蛋白酸鈉已較好的水合，但仍有部分未水合充分的蛋白顆粒存在。這是由于高蛋白中間水分食品模型體系的制備是一個蛋白質分子與水及其他小分子不斷相互作用的過程。圖2～圖4分別為酪蛋白酸鈉模型體系在25℃下貯藏1、3、7 d的FRAP結果圖。從圖2～圖4可以看出，新鮮制備的酪蛋白酸鈉模型體系是一個非熱力學穩定體系［13］，隨著貯藏時間的增長，水和其他小分子物質(甘油、山梨醇)從體相中向未充分水合的蛋白顆粒表面遷移，這些顆粒從體相中進一步吸水、溶脹，形成更大的、不規則的顆粒聚集體［14］，并與顆粒空隙間的蛋白膠質進一步共同形成交聯的網狀結構。另外，圖5顯示了新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系分別放大100倍和500倍的電子掃描顯微鏡圖。由圖5可以看出，新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系呈現連續且伴有一些不溶性顆粒和氣泡的結構狀態。

圖1 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第0天熒光漂白恢復Fig.1 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 0 day

圖2 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第1天熒光漂白恢復Fig.2 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 1st day

酪蛋白酸鈉模型體系的熒光漂白區域的熒光強度隨著貯藏時間的延長而逐漸恢復。起初，當酪蛋白酸鈉模型體系(第0天)被激光漂白后，漂白區域內的熒光強度恢復迅速，當熒光恢復至5 min時，便可見明顯胡熒光強度恢復;當熒光恢復至30 min時，整個漂白區域完成了熒光強度的恢復。而隨著貯藏時間的延長，當酪蛋白酸鈉模型體系分別貯藏至第1天和第3天時，漂白區域內的熒光恢復程度明顯放緩。根據公式1對漂白區域的熒光強度恢復率進行計算。圖6為酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏不同時間的熒光恢復率。其中，新鮮的酪蛋白酸鈉模型體系的熒光恢復率為69.54%;在酪蛋白酸鈉模型體系貯藏了1 d后，當熒光漂白恢復至240 min時，漂白區域的熒光恢復率為42.65%;而貯藏3 d后的酪蛋白酸鈉模型體系，當熒光漂白恢復至240 min時，漂白區域的熒光恢復率降為35.14%;而貯藏了第7天后的酪蛋白酸鈉模型體系，當熒光漂白恢復至240 min時，漂白區域的熒光恢復率只有12.63%。

通過酪蛋白酸鈉模型體系的熒光漂白恢復實驗和熒光強度恢復率的計算，實驗結果表明，酪蛋白酸鈉模型體系中的酪蛋白、以及水和甘油等小分子之間存在分子遷移的現象，且熒光強度恢復率越高、恢復時間越短，表明體系中分子遷移越迅速。而隨著貯藏時間的延長，酪蛋白酸鈉模型體系的熒光強度恢復率逐漸降低。這是由于酪蛋白酸鈉模型體系在貯藏初期分子遷移迅速，隨著小分子不斷地向蛋白顆粒遷移并與蛋白質分子相作用，使得模型體系內的分子不斷固化，制約了模型體系的整體流動性。

圖3 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第3天熒光漂白恢復Fig.3 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 3rd day

圖4 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏第7天熒光漂白恢復結果圖Fig.4 The fluorescence recovery after photobleaching of sodium caseinate model stored at 7th day

圖5 酪蛋白酸鈉模型體系電子掃描顯微鏡圖Fig.5 The SEM of sodium caseinate model

圖6 酪蛋白酸鈉模擬體系貯藏不同天數的熒光恢復率Fig.6 The fluorescence recovery rate of sodium caseinate model stored at different days

2.2 濃縮乳蛋白模型體系熒光漂白恢復結果

圖7為濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第0天的FRAP結果圖。新鮮的濃縮乳蛋白模型體系中存在有部分的未充分水合的蛋白顆粒，并有較多氣泡存在。圖8～圖10分別為濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第1、3、7天的FRAP的結果圖。隨著儲藏時間的延長，體系中氣泡的尺寸逐漸變小直至消失，說明體系內伴隨著分子遷移。圖11為新鮮濃縮乳蛋白模型體系分別放大100倍和500倍的電子掃描顯微鏡圖，可見濃縮乳蛋白模型體系為較多不溶性顆粒聚集體和氣泡構成的非連續狀結構。

圖7 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第0天熒光漂白恢復Fig.7 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 0 day

圖8 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第1天熒光漂白恢復Fig.8 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 1st day

圖12為濃縮乳蛋白模擬體系貯藏不同天數的熒光恢復圖。新鮮制備的濃縮乳蛋白模型體系(第0 d)經熒光漂白后，漂白區域內的熒光強度迅速恢復，以致漂白區域的輪廓呈模糊狀。當漂白區域恢復至15 min時，熒光強度則已恢復一半以上，熒光恢復率達53.33%。隨著貯藏時間的延長，濃縮乳蛋白模型體系在分別貯藏1 d和3 d后，熒光強度同樣恢復迅速。當熒光強度恢復至15 min時，漂白區域熒光強度恢復率分別達到47.44%和44.7%(圖12)。而貯藏7 d后的濃縮乳蛋白模型體系熒光漂白恢復稍有減緩，在恢復60 min后，熒光強度恢復率為43.14%。

由此可見，濃縮乳蛋白模型體系的熒光漂白恢復無論從恢復時間上，還是熒光強度恢復率上相比，都較酪蛋白酸鈉模型體系的熒光漂白恢復迅速，這可能是由于濃縮乳蛋白同時含有可溶性的乳清蛋白組分所致。且濃縮乳蛋白中含有酪蛋白組分，因此濃縮乳蛋白模型體系隨著貯藏時間的延長呈現與酪蛋白酸鈉模型體系相似的微觀結構。

圖9 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第3天熒光漂白恢復Fig.9 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 3rd day

3 結論

本研究通過分別構建酪蛋白酸鈉和濃縮乳蛋白這兩種高蛋白中間水分食品模型體系，并采用熒光漂白恢復技術對模型體系在貯藏過程中微觀結構的變化進行觀察。通過計算模型體系的熒光恢復率值，表明高蛋白中間水分食品在貯藏初期存在著蛋白質及小分子等的遷移運動。

圖10 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏第7天熒光漂白恢復Fig.10 The fluorescence recovery after photobleaching of milk protein concentrate model stored at 7th day

圖11 濃縮乳蛋白模型體系電子掃描顯微鏡圖Fig.11 The SEM of milk protein concentrate model

圖12 濃縮乳蛋白模擬體系貯藏不同天數的熒光恢復率結果圖Fig.12 The fluorescence recovery rate of milk protein concentrate model stored at different days

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