玉米醇溶蛋白高水解度酶解制備短肽

劉冬，周麗珍，李艷，孫海燕，唐旭蔚，從彥麗，萬紅霞

（深圳職業(yè)技術學院深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點實驗室，廣東深圳518055）

玉米醇溶蛋白高水解度酶解制備短肽

劉冬，周麗珍，李艷，孫海燕，唐旭蔚，從彥麗，萬紅霞

（深圳職業(yè)技術學院深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點實驗室，廣東深圳518055）

以高水解度水解蛋白為目標，對酶解玉米醇溶蛋白制備短肽的工藝進行了研究。選擇了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，采用均勻試驗設計法對三種酶的酶解工藝進行了考察，同時還對復合酶水解、理化前處理技術的作用進行了探討。實驗結果對三種酶的酶解工藝條件進行了優(yōu)化；明確了三種酶復合水解時，得到的水解度均顯著高于單酶水解結果，且其中以“堿性蛋白酶+中性蛋白酶+胃蛋白酶”順序的復合酶組合得到的水解度最高達（29.95± 0.87）%；考察的加熱、添加亞硫酸鈉、超聲等三種理化前處理技術，對玉米醇溶蛋白水解度沒有明顯的影響。總而言之，應用合適的蛋白酶及酶解方式，玉米醇溶蛋白水解制備短肽，可以達到較高的水解度。

酶解；肽；玉米醇溶蛋白；水解度

玉米醇溶蛋白中富含亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸以及谷氨酸，這些特殊的氨基酸組成使玉米醇溶蛋白成為多種生物活性肽，尤其是血管緊張素轉化酶（ACE)抑制肽的良好來源[1-5]。許多研究發(fā)現(xiàn)，具有ACE抑制活性的肽，其氨基酸序列雖各不相同，但多數(shù)都為相對分子質量較小的短肽（多為1 ku以下)。因此，在蛋白質水解時提高水解度，則更容易得到具有ACE抑制活性的短肽[6-8]。過去人們一直認為攝入的蛋白質或肽是在體內降解后以游離的氨基酸形式被吸收的，但是現(xiàn)代營養(yǎng)學研究發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質水解物主要是以短肽形式被吸收，利用度比游離氨基酸更好。相對分子質量小于1 ku的短肽極易被機體吸收利用，特別是二肽、三肽，可以完整的形式被機體迅速吸收并在體內發(fā)揮生理功效[9-10]。因此在進行蛋白質的酶解時，在保證短肽得率的前提下，應盡量提高蛋白質的水解度，使得到的短肽相對分子質量盡量較小。

酶法水解是目前以蛋白質為原料制備短肽的主要方法，選用恰當?shù)牡鞍酌杆猓嬖谟诘鞍踪|長鏈中的原非活性狀態(tài)的生物活性肽將被釋放出來[11-12]。關于酶法水解蛋白質的研究較多，但多數(shù)蛋白質在酶法水解時水解度往往很低，僅為百分之幾或是百分之十幾左右。酶作為專一性強的生物催化劑，具有選擇性高、酶活性受抑制因素復雜等特點。因此，為了讓蛋白酶充分發(fā)揮活性，得到高水解度，就應根據(jù)酶的酶切位點及原料的結構特性（包括如氨基酸組成、比例和活性肽的結構等），選擇恰當?shù)拿福瑫r確定水解過程中各主要因素的影響作用，讓酶解作用在最有利的條件下進行。

將以水解度為指標，對以玉米醇溶蛋白為原料酶解制備短肽的工藝進行研究。采用均勻試驗設計法對所選擇的酶的水解工藝進行探討及優(yōu)化，在此基礎上，考察復合酶水解作用、理化前處理作用對酶解效果的影響，以期為提高玉米醇溶蛋白的酶解效率的相關應用及研究提供一定的技術參考。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白：深圳職業(yè)技術學院深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點實驗室自制（以玉米黃粉為原料用70%乙醇提取，條件為：液料比10∶1（mL/g），功率超聲480W輔助處理27min）；堿性蛋白酶Alcalase2.4 L FG（標定活力：2.4 AU/g）、中性蛋白酶Neutrase 1.5MG（標定活力：1.5 AU/g），丹麥諾維信公司；胃蛋白酶Pepsin 1∶10000（標定活力310 000U/g）：美國sigma公司；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸和亞硫酸鈉等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSA 224S電子天平：德國Sartorius公司；Rw 20數(shù)顯型攪拌器：德國IKA混合分散生產設備公司；pHS-3C型數(shù)顯式pH計：上海宇隆儀器有限公司；ES-315高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；VCX600超聲破碎儀：美國Sonics公司；5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

2 實驗方法

2.1 蛋白酶的選擇

酶解蛋白質制備活性短肽時，應盡量選擇內切酶，可以避免酶解產物出現(xiàn)過多的游離氨基酸。根據(jù)ACE抑制肽的結構特點，酶切位點在疏水性氨基酸或芳香族氨基酸的蛋白酶，其酶解作用結果得到ACE抑制肽的幾率較大[13-14]。再綜合考慮實際生產運用中酶的作用條件以及酶的生產成本，本研究選用了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶3種蛋白酶進行酶解實驗。

2.2 單酶水解條件的研究

玉米醇溶蛋白的酶解工藝：玉米醇溶蛋白粉碎后過80目篩，按一定液料比（體積/質量）加入蒸餾水配制成200mL懸浮液，攪拌均勻。將溫度與pH調至試驗用酶的最適條件下，添加酶進行酶解反應。水解結束后于95℃水浴鍋內保持20min對酶進行滅活，冷卻后將水解液4 000 r/min離心15min，取上清液測定水解度。

2.2.1 堿性蛋白酶水解條件的均勻試驗設計

按玉米醇溶蛋白的酶解工藝，固定堿性蛋白酶作用的最適pH和溫度（pH=8.5，T=55℃)，以水解度為指標，選取底物濃度、酶底比和水解時間3個因素，按照DPS軟件設計的均勻試驗U8（43）進行試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 堿性蛋白酶酶解的均勻試驗設計因素和水平Table 1 Variables and levels in Uniform design of alcalase hydrolysis process

2.2.2 中性蛋白酶水解條件的均勻試驗設計

按玉米醇溶蛋白的酶解工藝，固定中性蛋白酶作用的最適pH和溫度（pH=7.0，T=50℃），以水解度為指標，選取底物濃度、酶底比和水解時間3個因素，按照DPS軟件設計的均勻試驗U10（53）進行試驗，試驗因素水平見表2。

2.2.3 胃蛋白酶水解條件的均勻試驗設計

按玉米醇溶蛋白酶解工藝，固定胃蛋白酶作用的最適pH（pH=2.0），根據(jù)酶的產品說明和相關文獻進一步對Pepsin 1∶10 000作用溫度進行優(yōu)化，以水解度為指標，選取溫度、底物濃度、酶底比和水解時間4個因素，按照DPS軟件設計的均勻試驗U10（101×53）進行試驗，試驗因素水平見表3。

表2 中性蛋白酶酶解的均勻試驗設計因素和水平Table 2 Variables and levels in Uniform design of neutrase hydrolysis process

表3 胃蛋白酶酶解的均勻試驗設計因素和水平Table 3 Variables and levels in uniform design of pepsin hydrolysis process

2.3 復合酶水解條件的研究

玉米醇溶蛋白粉碎后過80目篩，按一定液料比（體積/質量）加入蒸餾水配制成200mL懸浮液，攪拌均勻。將溫度與pH調至第一種試驗用酶的最適條件，添加第一種蛋白酶進行酶解反應。之后依次分別在另兩種蛋白酶的最適水解條件下繼續(xù)對醇溶蛋白進行酶解。整個水解過程結束后于95℃水浴鍋內保持20min對酶進行滅活，冷卻后將水解液4 000 r/min離心15min，取上清液測定水解度。考察堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶三種酶的不同添加順序組合對水解度的影響。

2.4 理化前處理對玉米醇溶蛋白水解度的影響研究

將玉米醇溶蛋白粉碎后過80目篩，按一定液料比（體積/質量）加入蒸餾水配制成200mL懸浮液，分別進行各種理化前處理，之后按復合酶水解的優(yōu)化條件進行玉米醇溶蛋白的酶解。考察的理化前處理技術包括：加熱處理、添加亞硫酸鈉處理和超聲處理。具體前處理方式為：

加熱前處理：分別將蛋白懸浮液調節(jié)至一定溫度（27、70、90、120℃）保持處理30min。考察不同的加熱處理溫度對水解度的影響。

超聲前處理：將蛋白懸浮液置于超聲破碎儀中以一定功率（0、120、240、360、480W）超聲處理10min，采用間歇處理模式（超聲5 s，間歇5 s）。考察不同超聲功率對水解度的影響。

2.5 水解度的測定

水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定采用甲醛滴定法[15]。

3 實驗結果與分析

3.1 堿性蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化

表4是通過均勻試驗設計得到的堿性蛋白酶水解實驗結果。

表4 堿性蛋白酶水解均勻設計表及水解結果Table4 Uniform design matrix and experimental results for Alcalase hydrolysis process

根據(jù)表4的數(shù)據(jù)，通過DPS軟件建立多元回歸模型，采用二次多項式逐步回歸，得到Alcalase 2.4 L FG酶解玉米醇溶蛋白的回歸方程：

研究結果表明，在堿性蛋白酶水解試驗中，底物濃度對水解度的影響最顯著，且為負相關，存在明顯的底物抑制現(xiàn)象。水解度隨酶底比的增加、水解時間的延長而增大；但隨著水解時間的延長，水解度反而減小，這可能是反應產物的抑制增強。回歸方程相關系數(shù)R=0.992 7，P=0.035 7，表明回歸方程能夠很好地反映堿性蛋白酶水解醇溶蛋白的水解度與各因素的關系。通過回歸方程模擬，獲得進行堿性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最佳理論組合為：底物濃度3%、酶底比80mAU/g、水解時間123min。在此工藝條件下進行酶解玉米醇溶蛋白實驗，得到蛋白水解度為19.61%。

3.2 中性蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化

表5是通過均勻試驗設計得到的中性蛋白酶水解實驗結果。

不得不說，黃梁是一個好男孩。他的父親在官場叱咤風云，但他卻簡單純真。當然，我們的交往是地下式的，這一點是我提出來的。黃梁不解地問，林林，為什么要偷偷摸摸的，年輕人談戀愛，你未嫁我未娶，有什么見不得人的？

表5 中性蛋白酶酶水解均勻設計表及水解結果Table5 Uniform design matrix and experimental results for Neutrase hydrolysis process

根據(jù)表5的數(shù)據(jù)，通過DPS軟件建立多元回歸模型，采用二次多項式逐步回歸，得到Neutrase1.5MG酶解醇溶蛋白的回歸方程：

研究結果表明，中性蛋白酶水解試驗與堿性蛋白酶水解規(guī)律相似，底物濃度對水解度的影響為負相關。水解度隨酶底比的增加、水解時間的延長而增大，但同樣水解時間存在一個最適值。回歸方程相關系數(shù)R=1，P=0.005 7，表明回歸方程很好地反映了中性蛋白酶水解醇溶蛋白的水解度與各因素的關系。通過回歸方程模擬，獲中性蛋白酶水解醇溶蛋白的最佳理論組合為：底物濃度2%、酶底比46 mAU/g、水解時間135min。在此工藝條件下酶解玉米醇溶蛋白，得到水解度為15.20%。

3.3 胃蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化

表6是通過均勻試驗設計得到的胃蛋白酶水解實驗結果。

根據(jù)表6的數(shù)據(jù)，通過DPS軟件建立多元回歸模型，采用二次多項式逐步回歸，得到Pepsin 1:10 000酶解玉米醇溶蛋白的回歸方程：

表6 胃蛋白酶水解均勻設計表及水解結果Table 6 Uniform design matrix and experimental results for Pepsin hydrolysis process

研究結果表明，和堿性蛋白酶、中性蛋白酶水解規(guī)律相似，胃蛋白酶水解時底物濃度對水解度的影響為負相關且為最主要影響因素。胃蛋白酶最適水解溫度對水解度的影響不顯著，考慮到生產成本選擇室溫25℃作為其最適酶解溫度。回歸方程相關系數(shù)R= 0.996 8，P=0.021 9，表明回歸方程能夠很好地反映胃蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的水解度與各因素的關系。通過回歸方程模擬，獲得胃蛋白酶水解醇溶蛋白的最佳理論組合為：溫度25℃、底物濃度2%、酶底比7 341U/g、水解時間66min。在此工藝條件下進行酶解玉米醇溶蛋白實驗，得到水解度為19.72%。

3.4 復合酶水解的作用效果

由單一蛋白酶酶解結果可知，底物濃度對水解度的影響顯著且呈負相關，因此低底物濃度有利于得到高水解度產品，如前述研究結果3種酶的最適底物濃度皆為2%或3%。但底物濃度過低則生產量低，在實際工業(yè)應用中不夠理想。因此本研究組將底物濃度提高至5%，考察采用復合酶水解的作用效果。本研究中復合酶水解依據(jù)3種酶先后加入順序的不同共有6種組合方式，各組合中，固定底物濃度為5%，3種酶在各自最適酶解條件下作用，不同組合對水解度的影響結果見圖1。

由圖1可知，各組合水解度均顯著高于20%，其中水解度最高可達（29.95±0.87）%（即組合3—“A+N+ P”的水解結果）。復合酶水解的水解度大大高于單酶水解，其原因可能是由于不同的酶作用位點不同，先作用的酶打開了蛋白質的部分結構，使后加入的酶的作用位點充分暴露，酶與底物充分結合，水解度增強。

圖1 3種蛋白酶不同水解作用順序對水解度的影響Fig.1 Effect of the hydrolysis order of three proteases on DH

3.5 理化前處理技術對水解度的影響

將玉米醇溶蛋白粉調成固形物含量為5%（m/v）的懸浮液，將蛋白懸浮液進行理化前處理，然后按復合酶組合3-“A+N+P”的酶解順序加入酶，水解玉米醇溶蛋白，測定最終水解度，各理化前處理條件對水解度的影響結果分別見圖2、圖3和圖4。

圖2 加熱處理的溫度對醇溶蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of heat pretreatment on DH

由圖2可以看出，在加熱前處理研究中，玉米醇溶蛋白的水解度隨溫度的變化不明顯，表明所采取的熱處理方式并不能促進蛋白底物發(fā)生更有利于與蛋白酶接觸的變化，如蛋白構象改變或蛋白質的肽鏈進一步舒展等[16]。

圖3 亞硫酸鈉濃度對醇溶蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of Na2SO3concentration on DH

亞硫酸鈉是通過斷裂蛋白質分子肽鏈中的二硫鍵來使蛋白結構松散，從而使酶與蛋白充分接觸而提高水解度[17-18]。而從圖3可知，添加亞硫酸鈉并不能明顯提高玉米醇溶蛋白的水解度。其原因可能是因為玉米醇溶蛋白來源于玉米濕法加工提取淀粉的副產物—黃粉，提取玉米淀粉時玉米已經過SO2處理。另外由黃粉提取的玉米醇溶蛋白中半胱氨酸的含量也較低，分子間和分子內二硫鍵含量少，即使被破壞也不足以造成蛋白結構的舒展變化，從而對水解度影響不大。

圖4 超聲功率對醇溶蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on DH

超聲處理對水解度的影響結果見圖4。超聲處理可應用超聲空化作用對蛋白底物的結構產生一定的促松散作用，從而使酶更容易與蛋白底物結合[19-20]。由圖4可知，超聲前處理功率的提高也并沒有提高醇溶蛋白的水解度。原因可能是玉米醇溶蛋白在從玉米黃粉中提取時已經過如超聲等各種輔助手段的處理，蛋白質內能被超聲作用影響的結構已不多，沒有新的鍵斷裂，即超聲對玉米醇溶蛋白結構的促松散作用已不明顯。

4 結論

對蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的工藝進行了研究，結果表明：選擇恰當?shù)拿福▔A性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶），優(yōu)化其水解工藝，并適當組合作用，可以得到較高的蛋白水解度（接近30%）。但若要繼續(xù)提高玉米醇溶蛋白水解度，目前而言較為困難。酶解反應過程中影響因素復雜，隨著反應的進行，許多新的抑制因素會形成，如反應產物可能反過來對蛋白水解形成產物抑制，其具體機制皆有待研究。另外，各種蛋白酶的特性、與底物的作用機制并未完全被解釋清楚，如本研究中采用的理化前處理在其他某些蛋白中適用而在這里卻沒有顯著效果。這些結果都表明，要讓酶解技術能夠精確、可控地水解蛋白并順利地工業(yè)化生產，我們還需要做更多的努力，進一步發(fā)現(xiàn)蛋白質酶解技術的內在規(guī)律。

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Preparation of Short Peptides from Zein via Enzymatic Hydrolysis with High Degree of Hydrolysis

LIU Dong，ZHOU Li-zhen，LI Yan，SUN Hai-yan，TANG Xu-wei，CONG Yan-li，WAN Hong-xia
（Shenzhen Fermentation，Purification and Testing System Key Laboratory，Shenzhen Polytechnic，Shenzhen 518055，Guangdong，China）

For the purpose of obtaining short peptides from zein via enzymatic hydrolysis with high degree of hydrolysis，the preparation technology was studied.Alcalase，neutrase and pepsin were applied in the research. The hydrolytic process of each protease was investigated via uniform design experiment.Basing on these experiments，the effects of multiple enzyme hydrolysis and the effects of physics and chemistry pretreatment techniques on enzymatic hydrolytic process were also discussed.At last，the hydrolytic process of each protease was optimized.The results showed that the DH values of all multiple enzyme hydrolysis processes were significantly higher than which of single enzyme hydrolysis processes.Furthermore，the DH value of multiple enzyme hydrolysis process with sequence of"alcalase+neutrase+pepsin"was the highest of all（the DH value was up to 29.95±0.87%）.As for all physics and chemistry pretreatment techniques in this study，i.e.heat treatment，application of Na2SO3and ultrasonic treatment，they had no significant effects on the DH of zein.In a word，while preparing short peptides from zein，high DH value should be obtained via proper proteases and appropriate hydrolysis processes.

enzymatic hydrolysis；peptide；zein；degree of hydrolysis（DH)

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.010

2014-07-28

廣東省科技計劃項目（2011B010500006）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B10）；深圳市科技計劃項目（ZDSY20120619093923525）；深圳職業(yè)技術學院校級重點項目（2210k3070013）；廣東省高等職業(yè)院校珠江學者崗位計劃資助項目（2011年度）

劉冬（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：營養(yǎng)與保健食品、生物活性成分研究。