谷氨酰胺轉氨酶菌株的篩選及其產酶條件研究

宋小平，王雅潔，王迎新，沈書文，李光偉

（1.安徽醫(yī)學高等專科學校藥學系，安徽合肥230601；2.合肥天麥生物科技發(fā)展公司，安徽合肥230031；3.中國科技大學生物工程中試基地，安徽合肥230022）

谷氨酰胺轉氨酶菌株的篩選及其產酶條件研究

宋小平1，王雅潔1，王迎新1，沈書文2，李光偉3

（1.安徽醫(yī)學高等專科學校藥學系，安徽合肥230601；2.合肥天麥生物科技發(fā)展公司，安徽合肥230031；3.中國科技大學生物工程中試基地，安徽合肥230022）

利用蛋白質交聯-絮凝沉淀性能測定方法，從土壤中分離得到1株高產谷氨酰胺轉氨酶（microbial transglutaminase，MTG）的菌株，命名為HF-82，初步確定為鏈霉菌屬。單因素試驗確定最適產酶氮源和碳源分別是蛋白胨和葡萄糖，正交試驗確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖25.0，蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，MgSO4·7 H2O 2.0，K2HPO4·3 H2O 2.0，NaH2PO42.0，CaCO33.0，pH 7.0。此發(fā)酵工藝條件下，MTG的酶活可達到0.53 U/mL。

蛋白質交聯-絮凝沉淀法；谷氨酰胺轉氨酶；菌種選育；產酶條件

谷氨酰胺轉氨酶（Microbial transglutaminase，簡稱MTG，EC2，3，2，13），是一種催化酰基轉移反應的轉移酶。由于其具有在蛋白質間架橋形成ε-（γ-Glu）-Lys的異型肽鍵[1]，將蛋白質共價交聯聚合，使蛋白質改性，該酶已經在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、分析檢測和生物工程等方面取得廣泛應用，因而具有很大的研究開發(fā)空間[2-4]。

微生物發(fā)酵法生產的谷氨酰胺轉氨酶成本低，吸引了國內外學者的關注和興趣。在谷氨酰胺轉氨酶的發(fā)酵生產中，獲得優(yōu)良的菌種十分關鍵。近年，黃六容[5]利用設計的低廉簡便的凝膠法從土壤中分離得到1株高產谷氨酰胺轉氨酶。Claucia F[6-7]等報道運用蛋白質交聯－絮凝沉淀法，在亞馬遜河附近篩選到一株產谷氨酰胺轉氨酶的菌，該菌產生的MTG能減少酪蛋白、大豆分離蛋白和水解動物蛋白的自由氨基，并對酪蛋白顯示出明顯的蛋白質交聯作用。目前已報道的微生物谷氨酰胺轉氨酶菌株主要屬于放線菌類的鏈霉菌屬[4-8，9]。

采用蛋白質交聯－絮凝沉淀法初步估測菌株是否產酶[10-12]，再用經典的比色法測定酶活大小并對其發(fā)酵條件進行了初步探討，為該酶應用于發(fā)酵生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤采集

參照土樣采集方法[12-14]，選擇有機質豐富的沃土、堆肥采集土樣[15]，自合肥板橋屠宰場、合肥蜀山奶牛場、岳西縣屠宰場、奶牛場附近菜園、安徽醫(yī)學高等專科學校校園花圃取土樣共17份，每份重約500 g，土樣采集時間為2011年10月10日至11月10日。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 初篩分離培養(yǎng)基（g/L）

精氨酸0.83，甘油12.5，NaC1 1.0，MgSO4·7H2O 2.0，土壤浸出汁200，瓊脂15.0，水800。滅菌后加入無菌過濾的放線菌酮0.05，制霉菌素0.08。

1.2.2 斜面種子培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基。

1.2.3 液體種子培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母膏5.0，MgSO4· 7H2O 2.0，K2HPO4·3H2O 2.0，NaH2PO42.0，pH 7.0。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖25.0，蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，MgSO4· 7 H2O 2.0，K2HPO4·3 H2O 2.0，NaH2PO42.0，Ca CO33.0，pH7.0。

1.3 試劑

cycloheximide（放線菌酮），nystatin（制霉菌素），Caseinscase（酪蛋白），CBZ-Gln-GLy和r-單異氧肟酸均購自Sigma公司，其余均為國產分析純試劑。

1.4 方法

1.4.1 菌種分離

取土壤樣品1.0 g，加入9mL無菌水中制成懸浮液，充分振蕩靜置30min后取上層懸液，依次制備成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同濃度的稀釋液，取0．2mL不同濃度的稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)5 d～7 d，觀察菌落形態(tài)，從平板挑取放線菌菌落進行劃線培養(yǎng)，直至得到純培養(yǎng)。

1.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法

將分離的菌種于斜面培養(yǎng)基中活化后，取一環(huán)斜面孢子，接入液體種子培養(yǎng)基，接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基的200m L的三角瓶中，28℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)好的液體種子按10%的接種量接人裝有40mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃，200 r/min恒溫培養(yǎng)至第3天，離心得到上清液。

1.4.3 凝膠法初篩產酶菌株[15-17]

1 g酪蛋白用少量NaOH濕潤后，再加入磷酸緩沖液（0.02mol/L，pH 6.5）使酪蛋白濃度達到12%.酪蛋白溶液與發(fā)酵上清液按一定比例混合均勻，于37℃反應3 h后靜置，觀察實驗現象，依據是否有凝絮或沉淀產生判斷是否產MTG，并大致估計酶活性。

1.4.4 比色法復篩產酶菌株[16，18]

對產生凝膠現象的菌株再用比色法進行復篩，測定上清液的谷氨酰胺轉酶活力，進行酶活、細胞干重和pH測定。

1.4.5 產酶菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化

單因素試驗確定MTG發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨和酵母膏，在此基礎上，以葡萄糖、蛋白胨和酵母膏為3個優(yōu)化因素，每個因素選取3個水平，確定因素水平表，如表1所示。以MTG酶活為優(yōu)化指標，按下表進行L9（33）的正交實驗。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的因素和水平表Table1 Factors and levels of optimization of fermentation medium

1.5 測定方法

1.5.1 生物量的測定

取10mL發(fā)酵液經4 000 r/min離心10min，蒸餾水洗滌沉淀2次，離心收集沉淀，于105℃烘干至恒重，稱重。

1.5.2 MTG酶活測定方法

比色法[14，21-22]等測定酶活，底物試劑中各 物質的濃度分別是：鹽酸羥胺0.1mol/L，CBZ-Gln-Gly 30 mmol/L，Tris-乙酸緩沖液0.2mol/L（pH 6.0），還原型谷胱甘肽10mmol/L。1mL底物試劑與0.2m L上清液37℃預熱5min后，混合、反應10 min，迅速加入1 mL終止液（5%FeCl3·6H2O：12%三氯乙酸：3mol/L鹽酸=1∶1∶1）終止反應，4 000 r/min離心，棄去沉淀，在525 nm下測上清液的吸光度，參比可用失活的酶液代替。一個MTG酶活單位（U/mL）定義為在37℃，pH 6.0的條件下反應1min生成1 umol氧肟酸的量。以L-谷氨酸-γ-單羥胺酸（氧肟酸）作標準曲線。

2 結果與討論

2.1 初篩試驗

首先，從稀釋梯度涂布平板的上，根據菌落形態(tài)初步挑出135株放線菌，再結合生長形狀及顯微鏡檢結果挑出73株放線菌，將這些放線菌菌落，經平板劃線分離并傳代培養(yǎng)2代～3代。

我們對二次初選得到的73株放線菌以蛋白質交聯凝絮-沉淀性能測定試驗進行初篩。發(fā)現有4個菌株有明顯的凝絮-沉淀現象產生，所有發(fā)生交聯凝聚反應的菌株均進行2次或3次重復試驗，不同批次實驗中出現的現象基本一致，分別命名HF-11、HF-45、HF-82、HF-105。

2.2 復篩試驗

對初篩得到的4個菌株進行復篩試驗，搖瓶發(fā)酵得到的上清液進行比色反應測定MTG酶活，所有菌株都在一定程度上產生MTG，而且菌株的產酶能力和蛋白質交聯凝絮結果相吻合。試驗結果酶活性最高的是HF-82號為0.41U/mL，所以以該菌株為出發(fā)菌株作進一步鑒定和優(yōu)化分析。

2.3 產MTG菌株的初步鑒定

HF-82菌株在平板上培養(yǎng)7 d后，菌落呈圓形，凸起，灰白色，邊緣不規(guī)則狀。采用插片法培養(yǎng)，于不同時期在顯微鏡下觀察氣生菌絲、基內菌絲、孢子絲的形態(tài)特征。氣生菌絲豐富，灰色、基內菌絲褐色，孢子絲有不同程度的輪生，符合鏈霉菌的特點。初步鑒定該菌為放線菌中的鏈霉菌屬。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1 不同碳源和氮源對HF-82菌株生物量與產酶的影響

分別選擇不同碳源、氮源替代基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨進行發(fā)酵產酶試驗，測定生物量和酶活性，結果見表2。

表2 HF-82菌株在不同碳源、氮源上的MTG酶活性和生物量Table2 Biomass and MTG activity of strain HF-82 on different carbon sources and nitrogen sources

結果表明，不同碳源、氮源對HF-82菌株細胞生長和產酶影響較大，以葡萄糖為碳源時細胞生長最好，同時酶活也最高，其生物量和酶活分別為16.28 g/L、0.41 U/mL，其次是麥芽糖，生物量和酶活分別為15.67 g/L、0.34U/mL，故以下試驗中采用葡萄糖為碳源；氮源中，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白等有機氮源均可顯著促進細胞生長，以蛋白胨為氮源，酶活最高，達到0.46U/mL，而以無機硫酸銨為氮源時，不產酶，可見蛋白胨在供試氮源中為最好的氮源，因而后續(xù)試驗以蛋白胨為最佳氮源。

2.4.2 最適產酶培養(yǎng)基配方的確定

在單因素試驗的基礎上，以葡萄糖、蛋白胨和酵母膏為3個優(yōu)化因素，每個因素選取3個水平，以MTG酶活為優(yōu)化指標，按下表進行L9（33）的正交實驗，結果如表3所示。

表3 正交設計實驗結果Table 3 Experimental results of orthogonal design

從表3可以看出，3個因素對產酶的影響程度為：葡萄糖>蛋白胨>酵母提取物。說明葡萄糖、蛋白胨對酶活影響最大，為主要影響因素；酵母提取物對酶活影響小，為次要影響因素。因此，葡萄糖選取A2，蛋白胨選取B2，次要影響因素酵母提取物以節(jié)約為原則選取C1或C3，并用A2B2C1和A2B2C3各做1次驗證試驗，結果如表4所示。

表4 正交試驗的驗證試驗Table4 Proof testing of orthogonal experiment

正交試驗的驗證試驗表明，A2B3C2的酶活為0.52 U/mL，A2B3C1酶活為0.53U/mL，故確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為A2B3C1。所以，本試驗中MTG發(fā)酵培養(yǎng)基組合為（g/L）：葡萄糖25.0，蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，MgSO4·7H2O2.0，K2HPO4·3H2O2.0，NaH2PO42.0，CaCO33.0，p H7.0。此時酶活達0.53U/m L。

2.5 菌體細胞的生長與產酶曲線

在HF-82菌株發(fā)酵產酶過程中，每隔8小時取樣，測得菌體細胞的生長與產酶曲線分別見圖1和圖2。

圖1 菌體細胞的生長曲線Fig.1 The growth curve of HF-82

圖2 菌體細胞的產酶曲線Fig.2 The enzyme activity curve of HF-82

由圖1、2可知，菌體生長量和MTG的酶活與時間呈相關性；在發(fā)酵中期，細胞生長量和MTG酶活都不斷增加，經過一段時間之后，菌體生長從指數生長末期開始進人穩(wěn)定生長期，酶活也達到最高，并隨發(fā)酵時間的延長而略有下降。所以，最佳的發(fā)酵時間為80 h，此時酶活最大，為0.53U/m L。

3 結論

本研究從土壤中篩選分離得到的菌株HF-82初步優(yōu)化后，其發(fā)酵液的MTG酶活達0.53U/mL，但是與內外研究的最大表達量尚有差距。下一步將通過擴增谷氨酰胺轉氨酶基因，構建表達質粒，建立高密度發(fā)酵工藝和簡便有效的MTG包涵體復性方法，提高HF-82菌株的酶活。

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Screening of Microbial Transglutaminase Producing Strain and Optimazation of Fermentation Conditions

SONG Xiao-ping1，WANG Ya-jie1，WANG Ying-xing1，SHENG Shu-wen2，LI Guang-wei3
（1.Department of Pharmacy，Anhui Medical College，Hefei230601，Anhui，China；2.Hefei Tianmai Biopharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Hefei 230031，Anhui，China；3.Biology Engineering Test Base，University of Science and Technology of China，Hefei 230022，Anhui，China）

A high transglutaminase-producing strain was isolated through a protein cross-linked-flocculation precipitate method，which was identified primarily to be a species of Streptomyces sp.The single factor experiments showed that the optimal carbon and nitrogen sources were glucose and peptone.The optimum medium composition was glucose25.0 g/L，Peptone 20.0 g/L，Yeast extract 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，K2HPO4·3H2O 2.0 g/L，NaH2PO42.0 g/L，CaCO33.0g/L received by Orthogonal Experimental Design.Under this fermentation process，the enzyme activity was promoted to0.53U/mL.

proteincross-linked-flocculation precipitate method；transglutaminase；screening；fermentation conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.030

2014-06-29

安徽省教育廳自然科學研究重點項目（KJ2010A201）；安徽省專業(yè)帶頭人培養(yǎng)資助項目（皖教秘人[2013]189號）

宋小平（1968—），女（漢），教授，碩士，從事生物制藥的教學和研究工作。