液相色譜測定水產(chǎn)品中組胺含量不確定度評估

胡禮淵，孫高英，廖和菁

（廣西東興出入境檢驗檢疫局，廣西東興538100）

液相色譜測定水產(chǎn)品中組胺含量不確定度評估

胡禮淵，孫高英，廖和菁

（廣西東興出入境檢驗檢疫局，廣西東興538100）

根據(jù)GB/T 20768-2006魚和蝦有毒生物胺的測定原理，建立不確定度評定數(shù)學(xué)模型，評估該方法在分析過程中的不確定度來源，計算檢測過程中引入的各個不確定度分量，并計算檢測結(jié)果的合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。

高效液相色譜；組胺；不確定度

國際實驗室認(rèn)可合作組織（ILAC）在發(fā)布的國際標(biāo)準(zhǔn)17025中，要求認(rèn)可實驗室應(yīng)用GUM評估和報告測量不確定度[1]。測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[2]，隨著食品安全問題受到越來越廣泛的關(guān)注，測量不確定度可為食品檢驗的準(zhǔn)確性和可靠性提供真實、有效依據(jù)。

組胺是一種低分子雜環(huán)族有機(jī)化合物，由組氨酸在摩根氏變形桿菌、組胺無色桿菌等細(xì)菌和組氨酸脫羧酶的作用下脫去羧基后形成，是生成致癌物質(zhì)和亞硝基類物質(zhì)的前體，也是生物胺中毒性最大的胺類，對人體健康的危害極大。我國規(guī)定鮐魚中組胺含量≤100mg/100 g，其他魚類中組胺含量≤30mg/100 g。本次實驗根據(jù)測量不確定度評定的通用準(zhǔn)則[1-2]對GB/T 20768—2006《魚和蝦中有毒生物胺的測定》進(jìn)行了不確定度評定，為該方法的控制和檢測報告的評估提供參考，最終給出測量結(jié)果的置信區(qū)間和置信水平。

1 實驗部分

1.1 方法原理

試樣中的組胺用高氯酸溶液提取，經(jīng)丹酰氯衍生化后，用液相色譜—紫外檢測器檢測，外標(biāo)法定量。

1.2 設(shè)備和色譜條件

1.2.1 設(shè)備

AgiLent高效液相色譜儀1200：配有紫外檢測器；離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速5 000 r/min；均質(zhì)機(jī)，移液器10μL～100μL和100μL～1 000μL。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：AgiLentC18；流動相：A 0.01moL/L乙酸銨；B水+乙腈（10+90）含0.01moL/L乙酸銨；流速：1.0mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.3 測定步驟

稱取2 g樣品，精確至0.01 g，置于50mL離心管中，加入10 mL 0.4 moL/L高氯酸溶液，均質(zhì)1 min，4 000 r/min離心5min，上清液移入25mL容量瓶中，沉淀物用10mL 0.4moL/L高氯酸溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，用0.4moL/L高氯酸定容至刻度。取1.0mL提取液加入5m L容量瓶中，依次加入0.1m L 2moL/L氫氧化鈉溶液、0.3mL飽和碳酸氫鈉溶液和2mL 10mg/mL丹酰氯溶液，蓋塞，于40℃避光反應(yīng)45min，然后加入0.1mL 25%～28%氫氧化銨，靜置30min，用乙腈定容到刻度，取1mL過0.45μm濾膜進(jìn)樣，紫外檢測器檢測。自動進(jìn)樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液10μL注入進(jìn)樣口，制得色譜圖。校準(zhǔn)曲線取5個濃度點，重復(fù)兩次進(jìn)樣，以峰面積響應(yīng)值對標(biāo)樣濃度繪制工作曲線，外標(biāo)法定量，計算標(biāo)準(zhǔn)平均峰面積。同時作空白實驗，測量兩份樣品，將樣品平均峰面積和標(biāo)準(zhǔn)平均峰面積比較計算。

2 數(shù)學(xué)模型

式中：X為樣品中組胺的含量，（mg/kg）；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中組胺的濃度，（μg/mL）；V為試樣溶液定容體積，mL；m為最終試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，g。

3 不確定度來源及其評定

3.1 不確定度分量來源及構(gòu)成圖

根據(jù)實驗過程及數(shù)據(jù)模型分析，組胺含量測定的測量不確定度來源主要包括：測量重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、線性最小二乘法擬合曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配置的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。其中，標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的不確定度由兩個部分組成。一部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引起的不確定度；另一部分是標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引起的不確定度，其中包括玻璃量器容量誤差引起的不確定度、定容體積、溫度的變動以及天平稱重引起的不確定度。具體構(gòu)成如圖1所示。

圖1 不確定度分量來源及構(gòu)成圖Fig.1 Sources of uncertainty components and structural diagram

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置引入的不確定度

3.2.1 質(zhì)量引起的不確定度

3.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的不確定度

組胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書標(biāo)明的純度為99%，不確定度為0.5%，按正態(tài)分布，擴(kuò)展因子K=3，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1reL=0.5/3×99=0.001 7

3.2.1.2 天平稱重的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

用1/1 000天平稱量0.016 57 g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，證書給出：0≤M≤50 g稱量誤差為±0.000 1 g，按矩陣分布考慮，擴(kuò)展因子。

3.2.2 溫度的變動引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度是在20℃條件下標(biāo)定的，假設(shè)實驗室溫度變化介于±2℃之間，按矩陣分布考慮，擴(kuò)展因子，水20℃的膨脹系數(shù)為2.1×10-4。

3.2.3 體積測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.3.1 定容體積引起的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液用10mL的容量瓶定容，根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》，A級10mL容量瓶的最大允差為±0.02mL，按矩陣分布考慮。

3.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配置標(biāo)準(zhǔn)溶液使用到1 000μL和100μL的移液器，根據(jù)檢定證書得知1 000μL的移液器不確定度為0.5%，100μL的移液器不確定度為0.1%，按矩形分布考慮。

體積測量引起的不確定度

因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液配置的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 測量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度

測量結(jié)果的重復(fù)性主要受樣品處理過程操作的一致性、樣品均勻性和儀器性能的影響，屬于A類評定，可以通過取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度加標(biāo)測定，測定10個相同濃度標(biāo)樣的樣品，檢測結(jié)果詳見表1。

單次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差按下式計算：

在日常的分析中，測量兩份樣品，報告平均值。兩次測量結(jié)果平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：

表1 相同濃度的10個標(biāo)樣檢測結(jié)果Table 1 The same concentration of10 standard test results

此分量綜合體現(xiàn)了測量儀器、體積測量、質(zhì)量測量和回收率等各方面的隨機(jī)影響。因此，在評定其它分量時不再考慮這些隨機(jī)影響。

3.4 定容后溶液濃度預(yù)估值的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)曲線取5個點，每個濃度點重復(fù)進(jìn)樣2次，結(jié)果如表2。

表2 重復(fù)2次測5個標(biāo)準(zhǔn)點的峰面積Table2 Repeat two times five standard points measured peak area

標(biāo)準(zhǔn)曲線一次方程為：Y=20.329X+4.585 7

樣品精制濃縮液定容后的濃度通過擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計算

式中：p為試樣平行測量次數(shù)；n為擬合直線的數(shù)據(jù)對數(shù)；y為試樣測量響應(yīng)值（p個）的平均值；y為繪制擬合曲線響應(yīng)值（n個）的平均值；xp為試樣測量預(yù)估值；x為繪制擬合直線輸入值xi（n個）的總平均值；yi-yfi為是輸入值為xi時，儀器響應(yīng)值與擬合直線上對應(yīng)的響應(yīng)值之差。

把xi分別代入Y=20.329X+4.5857得yfi，則。在本測量中，試樣測量響應(yīng)值y1=400.7，y2=392.5。利用擬合直線計算得到精致濃縮液定容后濃度：xp=19.3μg/mL。n=10，p=2，。

把相關(guān)數(shù)據(jù)代入上述公式計算得到由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：s（xp）=0.235 4μg/m L。其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4 不確定度分量列表

測定水產(chǎn)品中組胺含量不確定度各影響量的相對不確定度見表3。

表3 水產(chǎn)品中組胺測量不確定度分量Table3 Aquatic histamine measurement uncertainty components

5 合成不確定度

標(biāo)樣中組胺含量X的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定計算如下：

6 擴(kuò)展不確定度

置信區(qū)間95%，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為：U（X）=k×uc（X）=2×4.2=8.4mg/kg

7 結(jié)果報告

用高效液相色譜—紫外檢測法按GB/T 20768—2006規(guī)定的條件測定水產(chǎn)品中組胺的含量為（235.0± 8.4）mg/kg，包含因子k=2（95%置信區(qū)間）。

8 討論

從上述不確定度的評定分析得知，本方法測量結(jié)果的不確定度主要來源有三部分，其中，重復(fù)測量和擬合曲線引入的不確定度較為顯著，為主要來源。因此，在測量過程中，通過提高操作人員的檢測水平和熟練程度，保證樣品前處理過程的平行性，增加曲線中濃度點數(shù)值等措施，減小不確定度的數(shù)值，可獲得較為可靠的檢測結(jié)果。

[1]中國實驗室國家認(rèn)可委員會.CNAS-GL06:2006化學(xué)分析中不確定度的評估指南[M].北京:中國計量出版社,2006

[2] 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF1059-1999測量不確定度評定與表示[M].北京:中國計量出版社,1999

[3] 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJG196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京:中國計量出版社,2007

[4]中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 20768-2006魚和蝦中有毒生物胺的測定液相色譜-紫外檢測法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006

[5]曹玲,吳嫣艷,張妤琳,等.高效液相色譜法測定保健食品中西地那非的不確定度評定[J].廣州:現(xiàn)代食品科技,2012,28(7):890-893

[6]趙中輝,林洪,王林,等.常見水產(chǎn)品中生物胺的調(diào)查及分析[J].水產(chǎn)科學(xué),2012,31(6):363-366

Determination of Histamine Content Aquatic Evaluation of Uncertainty by HPLC

HU Li-yuan，SUN Gao-ying，LIAO He-jing
（Dongxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

According to GB/T 20768-2006 toxic biogenic amines in fish and shrimp measurement principle，the establishment of Uncertainty mathematical model to evaluate the method in the analysis of the sources of uncertainty，calculate the detection process introduced various uncertainty component，and calculate test results combined uncertainty and expanded uncertainty.

HPLC；histamine；uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.028

2013-08-16

胡禮淵（1979—），男（漢），助理工程師，主要從事水產(chǎn)品檢測工作。