RP-HPLC法測定藍莓和黑莓中VC的含量

劉志剛，候浪，王瑞，岑順友，劉曉燕，謝曉林

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005；2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽550005）

RP-HPLC法測定藍莓和黑莓中VC的含量

劉志剛1，2，候浪1，王瑞1，2，岑順友2，劉曉燕1，2，謝曉林1

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005；2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽550005）

建立了藍莓和黑莓中VC含量的高效液相色譜測定方法。樣品用0.5%草酸溶液低溫振蕩提取后，進行高效液相色譜分析，色譜柱為Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 m），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95），流速0.8 m L/min，檢測波長242 nm。研究結果表明，VC在0.02mg/mL～0.4mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r為0.999 6，平均加樣回收率為97.1%，RSD均小于3.0%。所建立方法快速簡便、準確度高，能夠用于測定藍莓和黑莓中VC的含量。

藍莓；黑莓；VC；HPLC；含量測定

藍莓為杜鵑花科越橘屬（Vaccinium.spp）多年生灌木，藍莓果實呈深藍色，被白霜，含有豐富的維生素、花色苷和多酚等生物活性成分[1-3]，有“水果皇后”的美譽。黑莓為薔薇科懸鉤子屬灌木，果實為黑色或者暗紫色聚合果，富含VC和鐵等微量元素，具有的抗氧化等多種生理活性[4-5]。目前測定水果中VC含量的方法很多，國標法采用2，6-二氯靛酚法測定，此外，還包括熒光光度法和分光光度法等[6-7]，但藍莓和黑莓果實均富含花色苷等天然色素，采用上述方法測定時干擾因素較多，有學者采用高效液相色譜法測定獼猴桃、刺梨等水果中VC的含量[8-9]，有文獻報道了藍莓中草酸、酒石酸、蘋果酸及鞣花酸等成分的HPLC含量測定方法[10-11]，而有關藍莓和黑莓中VC的HPLC測定方法鮮見文獻報道，本研究首次建立了RP-HPLC法快速測定藍莓和黑莓中VC的定量測定方法，并對7個不同品種藍莓和黑莓中的VC含量進行了測定，從而為藍莓和黑莓相關產品的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）：美國TEDIA公司；冰醋酸、磷酸均為分析純：重慶川江化工有限公司；水：為重蒸水，自制；VC對照品（批號：HG/T1534F1994，純度：99.0 %）：上海試四赫維化工有限公司；藍雨、北陸、園藍、芭爾德溫、梯芙藍、粉藍、燦爛等品種藍莓和黑莓鮮果均于2013年8月10日采自貴州省麻江縣宣威鎮龍崩藍莓基地。

1.2 儀器與設備

SHIMADZU高效液相色譜儀（LC-20AT輸液泵，SPD-M20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站）；AS3120A型超聲波提取器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；SHA-B恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；BCFCO型電熱恒溫水浴鍋：北京長風儀器儀表公司；JJ-2型組織搗碎機：金壇市易晨儀器制造有限公司；AUW 120D型分析天平：日本島津公司。

1.3 樣品制備方法

1.3.1 對照品溶液制備

稱取VC對照品10mg，精密稱定，置50mL棕色容量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀釋成濃度為0.2mg/mL的對照品溶液。

1.3.2 樣品溶液制備

稱取藍莓果漿約5.0 g，精密稱定，加入0.5%草酸溶液5mL溶解，5℃低溫下于振蕩器中提取20min，抽濾，濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液進行HPLC定量分析，黑莓供試品溶液的制備方法同上。1.4 HPLC色譜條件

色譜柱采用AgilentHC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）；流速0.8mL/min；檢測波長242 nm；進樣量20μL；柱溫為室溫。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

準確稱取一定量的VC對照品，精密稱定，分別置50m L棕色量瓶中，以0.1%磷酸溶液溶解并稀釋定容，分別配制成濃度為0.02、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL的VC工作溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾，按1.4項下色譜條件分析，由色譜峰面積和溶液濃度繪制標準曲線，結果VC在0.02mg/mL～0.4mg/mL范圍內線性關系良好，Y=4.32×107X-1.51×103，r=0.999 6。

2.2 精密度試驗

取同一藍莓果漿樣品，按照1.3.2項下方法制備樣品溶液，重復進樣6次，記錄色譜峰面積，計算VC峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），其平均RSD為0.6%，說明方法的精密度良好。

2.3 穩定性試驗

取供試品溶液，4℃低溫下放置24 h，分別在0、2、4、8、12、24 h測定，記錄色譜峰面積，計算得色譜峰峰面積的RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在4℃低溫下可保持24 h穩定；另取供試品溶液，室溫下放置8 h，結果色譜峰峰面積的RSD值已大于8.0%，表明樣品中VC在室溫下放置8 h不穩定。

2.4 重復性試驗

取同一批藍莓果漿樣品5份，按照1.3.2項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積，VC峰面積的RSD為1.2%，說明方法的重復性良好。

2.5 回收率試驗

精密稱取同一批已知含量的藍莓樣品，精密加入濃度為10μg/mL的VC標準溶液適量，按1.3.2項下制備方法供試液共5份，進樣分析，由測得量與加入量計算回收率，結果VC的平均加樣回收率為97.1%，相對標準偏差（RSD）不大于3.0%，表明方法準確度良好。2.6 樣品測定

分別取所采集到7個不同品種藍莓和1個黑莓樣品，照1.3.2項下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進樣20μL，采用外標法計算含量，結果藍莓中VC的含量分布在1.57mg/100 g～4.01mg/100 g范圍內，黑莓中VC的含量較低（見圖2）。

圖2 不同品種藍莓和黑莓鮮果中VC的含量Fig.2 The vitamin C content of different varieties of blueberry and blackberry in fresh fruit

3 結論

本方法以0.5%草酸溶液作為提取溶液，低溫振蕩提取藍莓和黑莓樣品中的VC，操作簡單快速，可避免樣品中VC被氧化和基質成分的干擾。采用高效液相色譜法進行測定時，在流動相中加入0.1%磷酸溶液作為酸抑制劑，色譜峰對稱性良好，既能達到基線分離的要求，又有適宜的保留時間，結果穩定準確，且靈敏度高，適合用于鮮果樣品中VC的測定。

采用所建立分析方法分別對產自我國南方藍莓主產地貴州省麻江縣7個不同品種藍莓和1個品種黑莓中的VC含量進行測定，由結果可知，不同品種藍莓中VC的含量相差十分懸殊，在所檢測7個品種中，粉藍中VC含量最高，藍雨VC含量最低，而各品種藍莓中VC的含量均遠高于黑莓，上述研究結果為藍莓和黑莓相關產品的開發利用提供參考。

[1] Prior R L,WU X L,GU LW,et al.Whole berries versus berry anthocyanins:interactions with dietary fat levels in the C57BL/6J mouse model of obesity[J].Journal of agricultural and food chemistry, 2008,56(3):647-653

[2]YIW G,AKOH C C,FISCHER J,et al.Absorption of anthocyanins from blueberry extracts by caco-2 human intestinal cell monolayers [J].Journal of agricultural and food chemistry,2006,54(15):5651-5658

[3] 胡雅馨,李京,惠伯棣.藍莓果實中主要營養及花青素成分的研究[J].食品科學,2006,27(10):600-603

[4]Seeram NP,Momin RA,Nair MG,et al.Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant cyaniding glycosides in cherries and berries[J]. Phytomedicine,2001,8(5):362-369

[5] Elisia I,Hu C,Popovich D G,et al.Antioxidant assessment of an anthocyanin-enriched blackberry extract[J].Food Chemistry,2007 (101):1052-1058

[6]傅維,楊彩霞.熒光分光光度法測定幾種天津市售水果中維生素C的含量[J]．安徽農業科學,2011,39(23):14392-14393,14411

[7]劉薇,王君,劉德明,等．分光光度法測定藍莓果中維生素C的含量[J]．湖南農業科學,2013(2):35-36

[8]李玉明,張少華.獼猴桃中維生素C的HPLC分析[J]．計算機與應用化學,2011,28(4):458-460

[9]肖竦.RP-HPLC法測定刺梨中的VC含量[J]．安徽農業科學,2011, 39(3):1356,1358

[10]胡小露,劉卉,魯寧,等.HPLC法同時測定藍莓汁及其發酵酒中9種有機酸[J]．食品科學,2012,33(16):229-232

[11]劉艷,宋立秋,范俊娟,等．HPLC法測定藍莓中鞣花酸含量[J]．江蘇農業科學,2008,11(3):217-219

Determination of Vitamin C in Blueberry and Blackberry by RP-HPLC

LIU Zhi-gang1，2，HOU Lang1，WANG Rui1，2，CEN Shun-you2，LIU Xiao-yan1，2，XIE Xiao-ling1
（1.Department of Food and Pharmaceutical Engineering，Guiyang University，Guiyang 550005，Guizhou，China；2.Guizhou Engineering Research Center for Fruit Processing，Guiyang 550005，Guizhou，China）

To develop a method for the determination of Vitamin C in blueberry and blackberry．An HPLC method has been developed to determine Vitamin C on Agilent C18（4.6 mm×250mm，5 m）column with the mobile phase of consisting of5%（v/v）methanol and 0.1%phosphoric acid．The flow rate was 0.8m L/min and the UV detection wavelength was set at 242 nm．The result showed that linearity of Vitamin C was good in the ranges of 0.02mg/mL-0.4mg/mL（r=0.999 6）．The average recovery of Vitamin C was97.1%with RSD less than 3.0%．The method is sample and accurate and could be used to control the quality of blueberry and blackberry．

blueberry；blackberry；VC；HPLC；assay

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.025

2014-01-29

貴州省教育廳產學研基地項目（黔教合KY字[2012]033號）；貴陽市科技局現代藥業計劃（筑科合同[2012204]31號）

劉志剛（1976—），男（漢），副教授，博士，主要從事食品質量安全與藥物分析研究工作。