MMP-- 33、MMP-- 9和TIIMP-- 1的動態平衡可作為心肌基質重構的重要標志

吳偉東，侯文進，劉 丹，易永盛，王躍軍，林葦嘉，周洋洋暨南大學第四附屬醫院//廣州市紅十字會醫院心胸外科，廣東 廣州 500；暨南大學第一臨床醫學院，廣東廣州50000

過去認為心臟重構只是由于心肌細胞內源性的變化，現在認識到心肌細胞外基質中膠原的數量、組成和結構的變化也參與了心臟重構，即基質組織修復再生的過程，并且是心室重構的重要原因，又稱為心肌基質重構［1］。心室重構是決定心臟病患者心功能及其預后的主要因素之一，是心臟基質成分合成或降解代謝失平衡的結果。心臟基質在維持心臟結構和功能完整性方面起著重要的作用。基質組織修復再生引起心肌纖維化和進行性心室擴張，最終導致心力衰竭［2］。在心肌中存在的能降解所有心臟基質成分的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs），是重構過程中心臟基質降解的主要因素［3］。在衰竭的心臟中，MMPs活性升高導致纖維膠原降解、細胞外基質重構，導致左室進行性擴張、收縮功能逐漸下降，MMPs在轉錄前和轉錄后水平都可被調節，而且可以通過底物間的相互作用和通過內源性生理抑制劑即基質金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMps）來調節［4］。因此MMPS、TIMPS及其調節因子間的相互作用決定了心肌纖維化過程的進展［5］。調節心肌MMPS、TIMPS的表達和活性，成為控制心衰進展中心臟基質的組織修復和再生的重要治療手段。因此，深入了解心肌基質的降解和重構對于明確基質金屬蛋白酶及其抑制劑在重構中的機制非常重要。此次項目我們將利用廣州市紅十字會醫院（暨南大學第四附屬醫院）的心臟病患者作為研究對象，通過了解心肌損傷以及手術后患者心肌基質重構情況，從MMPs和TIMps的動態平衡著手研究其對心肌基質的組織修復和再生作用，探尋影響心肌基質組織修復和再生的生物制劑和藥物，為心肌損傷后基質重構造成的心肌肥大、增厚等引起的心力衰竭提供的有效的生物檢測方法、新型檢測蛋白、生物制劑以及藥物治療和預防。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象及分組 納入2012年1月～2014年4月廣州市紅十字會醫院行體外循環心臟手術的患者為研究對象。術前心功能分級（NYHA）Ⅱ～Ⅲ級、美國麻醉師協會分級（ASA）Ⅱ～Ⅲ級，術前均無風濕活動及冠心病史，術前1個月未使用激素及非甾體類抗炎鎮痛藥等。術前血紅蛋白、凝血功能、電解質、肝、腎和肺功能均在正常范圍，按照隨機區組分組的方法根據進行的心臟手術不同，將研究對象分為3個組，第1組為先天性心臟病組（CHD組）；第2組為風濕性心臟病組（RHD組）；第3組為冠心病組（COR組），且術前經超聲心動圖檢查，未見房室的大小改變，設其為對照組。

1.1.2 標本采集與測定

1.1.2.1 標本采集（ELISA）分別于術前采血。（1）用含有EDTA的真空管對入選病人進行靜脈采血4～5 ml；（2）室溫靜置1 h；（3）離心，3000 r/min，15 min；（4）在垂直超凈臺內，用移液器將上清液移至1.5 ml離心管，及時蓋上管蓋。每個離心管移入l ml血漿。吸取液體時切勿過猛，以免引起污染，最后可適當留下一層少量上清液，以保證血漿的純度，離心管和槍頭均經過高溫滅菌處理；（5）貼上標簽，-80 ℃保存。

1.1.2.2 標本采集（Rt-PCR） 切除右心室內異常肌束，取約3 mm×3mm心肌組織立即置于凍存管內，貼上標簽，置于液氮速凍，-80℃冰箱保存，標本經倫理委員會審核并批準。

1.1.2.3 標本采集（免疫組化法） 另取心肌組織，約2 mm×2 mm2與標簽一起用紗布包好，大頭針固定（固定大頭針，避免損傷樣本）。放入裝有固定液的廣口瓶中固定，常溫保存。（所取心肌為右室異常肌束，經倫理委員會審核并批準）。

1.2 實驗步驟

1.2.1 ELISA（1）確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目；（2）分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加BSA（2%）0.l ml，余孔分別加標準溶液或待測樣品0.l ml，輕輕混勻，酶標板蓋上錫箔紙，37℃，120 min；（3）反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體，或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次；（4）將準備好的生物素抗體工作液按每孔0.l ml依次加入。37 ℃反應60 min；（5）PBS洗滌3次，每次浸泡1 min左右，甩干；（6）將準備好的ABC（底物）工作液按每孔0.l ml依次加入。37 ℃反應30 min；（7）PBS洗滌5次，每次浸泡1～2 min左右，甩干；（8）按每孔0.09 ml依次加入己在37℃平衡30 min的TMB顯色液，37℃避光反應，反應過程中，要經常觀察，當肉眼可見標準品的前3～4孔有明顯的梯度藍色，后3～4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.l ml/孔。（顯色反應最長不要超過30 min）；（9）用酶標儀在 450 nm測定OD值；（10）根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。

1.2.2 免疫組化方法測定心肌基質的膠原形態和分布（1）對切取心肌組織進行常規石蠟切片的制備；（2）進行HE染色，依次用二甲苯和酒精浸泡后，再依次用Harris蘇木素液、伊紅進行染色，酒精和二甲苯浸泡后用中性樹脂封片；（3）用SP法進行免疫組化染色，常規脫水后，用PBS沖洗3次，每次3 min；根據抗體要求，對組織抗原進行修復；將切片加一滴3%H2O250 μl，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次10 min；依次加入抗體、聚合增強劑，PBS沖洗后甩去，加入DAB或者AEC顯色液，待顯微鏡下顯色為紅色或者棕色時，蒸餾水清洗后，用蘇木素復染0.1%鹽酸酒精分化，后沖洗，PBS沖洗返藍，用DAB顯色，經梯度酒精脫水干燥后用中性樹脂封片。

1.2.3 rt-PCR技術對心肌組織中mmps和timps的mRNA進行檢測，查看其mRNA表達情況：（1）采用異硫氫酸胍—氯仿經典法進行RNA的提取；（2）cDNA的合成；（3）常規PCR反應；（4）熒光定量PCR反應，反應體系的配制嚴格按照試劑盒的操作順序。

1.3 計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。再利用SPSS17.0進行數據分析，運用多個實驗組和對照組比較的Dunnett法檢驗，取α=0.05。

2 結果

2.1 CHD、RHD、COR三組的臨床資料比較

經過統計學分析，三組患者在年齡、身高、體質量方面的差異無統計學意義（P<0.05）。排除年齡、身高、體質量對結果的影響。三組患者的超聲心動圖結果顯示：經完全隨機設計資料的方差分析，采用多個實驗組與一個對照組比較的Dunnett法，按α=0.05水準，可認為CHD組的RAD、LVEF與COR組均數的差異有統計學意義，說明CHD組的RAD、LVEF較COR組已經發生了不同程度的改變；而RHD組的LAD、LVED、LVEF、IVS與COR組的均數差異有統計學意義，明RHD組的LAD、LVED、LVEF、IVS較COR組也已發生了不同程度的改變（表1）。

表1 三組患者的臨床資料對比Tab.1 The clinical data of three groups patients

2.2 ELISA法對MMP-3、MMP-9、TIMP-1的檢驗結果（單位：μg/L）

通過對3組患者血液中基質金屬蛋白酶的ELISA法檢驗，采用完全隨機設計資料的方差分析，經多個實驗組與一個對照組比較的Dunnett檢驗，按α=0.05水準，CHD組和PHD組血液中的MMP-3、MMP-9、TIMP-1含量較COR組差異有統計學意義（P<0.05，圖1），可認為CHD組和PHD組血液中的MMP-3、MMP-9、TIMP-1含量較COR組高，而實驗組中CHD組與PHD組間的差異無統計學意義（P>0.05），說明CHD組和PHD組心臟基質已發生了不同程度的改變與重構。

圖1 MMP-3、MMP-9、TIMP-1在三組患者血中的含量CHD組與COR組比較,#P<0.05;PHD組與COR組比較,*P<0.05.Fig.1 The levels of MMP-3,MMP-9,TIMP-1 in three groups of patients with blood.

2.3 免疫組化檢驗結果

顯微鏡下MMP-3、MMP-9、TIMP-1呈彌漫性棕黃色或黃褐色顆粒。而正常心肌細胞則呈均勻、稀疏的淺褐色或粉紅色顆粒。經過Image-proplus圖像分析軟件定量分析：A1、B1的陽性表達結果較C1高，差異顯著，有統計學意義（P<0.05），鏡下可見到A1、B1的棕黃色或黃褐色顆粒較C1組明顯增多，且彌漫分布；同樣A2、B2的陽性表達結果較C2高，差異有統計學意義（P<0.05），鏡下彌漫性棕黃色或黃褐色顆粒較C2更加豐富；A3、B3的表達雖然較A1、B1、A2、B2要低，但是其陽性表達結果仍然高于C3，差異顯著（P<0.05），鏡下棕黃色或黃褐色顆粒仍較豐富，而C3則呈現彌漫淺褐色和粉紅色顆粒（圖2）。

2.4 PCR反應結果

經過聚合酶鏈反應定量檢測，CHD組和PHD患者MMP-3、MMP-9、TIMP-1的mRNA呈現高表達。經多個實驗組和一個對照比較的Dunnett法，Levene齊性檢驗,按α=0.10水準，3組資料的方差齊。按α=0.05水準，可認為CHD組和PHD組的MMP-3、MMP-9的mRNA表達高于COR組（表2）。

3 討論

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一組能特異地降解細胞外基質成分的鋅離子依賴的酶家族，在組織重構中起重要作用［6］。基質金屬蛋白酶與基質金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是膠原代謝的主要調節物質，兩者相互作用共同維持著心血管基質的分解與重構［7］。目前國內外對于心肌損傷后血管重建方面的研究比較深入，Hojo等[8]對急性心肌梗塞中基質金屬蛋白酶的表達進行了大量的研究，得出了急性心肌梗塞時很多基質金屬蛋白酶時升高的。Creemers等［9］對心衰進行研究時，發現一些金屬蛋白酶抑制劑對于阻止心衰的進展、抑制心衰有很大幫助。這對SPinale等［10-14］在前期對于心肌細胞蛋白分子以及基因表達方面的基礎研究起著極大的繼承和發揚。這就為我們現在的研究給予了巨大的提示。

圖2 MMP-3、MMP-9、TIMP-1的免疫組化形態分布A（CHD組）、B(PHD組）、C（COR)組，1（MMP-3)、2(MMP-9)、3(TIMP-1).Fig.2 The immunohistochemical species distribution of MMP-1、MMP-9、TIMP-1.

表2 三組患者的mRNA表達情況Tab.2 The mRNAexpression of three group

很多心臟疾病引起的心肌損傷、心臟手術，不可避免地使心肌受到了一定的損傷，雖然近年來心肌保護的研究取得了顯著的效果，但是對于心肌損傷引起的各種并發癥還是相對較多，檢測手段還是相對單一，陳舊，繁雜，必須綜合多方面檢查和檢驗結果，而且最終的特異性并不是令人滿意。目前對于MMPs和TIMPs的動態平衡在維持心肌細胞組織修復再生中的作用還缺乏前瞻性的研究，國內外對心肌損傷后引起的基質重構研究還處于初級階段［15］，因而對于新型檢測手段、新型檢測蛋白分子以及生物藥物的研究勢在必行，我們在前期的研究中，已經獲得了滿意的成績。此次項目，我們將對心臟病患者進行MMPs和TIMPs的動態平衡的研究，試圖探索MMPs和TIMPs的動態平衡在維持心肌細胞組織修復再生中的作用，從而尋找心肌損傷后基質重構的生物檢測方法、新型檢測蛋白、生物制劑以及藥物治療和預防。

在本次研究中，我們采用了多種方法對心肌損傷后導致的基質重構進行檢測，從定性和定量兩方面探討了心肌基質降解和斷裂的MMP-3、MMP-9蛋白在血液、組織中的表達，并且采用PCR技術對其mRNA的表達進行了定量的檢測。同時對阻止和抑制心臟基質發生降解和重構的基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1進行定量、定性以及mRNA表達的檢測。從全面的角度分析了MMP-1、MMP-9和TIMP-1在整個心肌基質變化過程中引起的量和質的變化。發現發生心臟基質重構的先天性心臟病組（CHD組）、風濕性心臟病組（PHD組）的MMP-3、MMP-9以及TIMP-1的表達都顯著高于未發生心臟基質重構的冠心病組（COR組）。這就說明，基質金屬蛋白酶及其抑制劑的動態平衡可能影響著心臟基質的降解和膠原的斷裂。對維持心肌的形態和膠原的結構有著巨大的作用，如何把握住這一關鍵點，維持這一動態平衡，阻止心肌損傷后導致的心臟重構，找出基因表達的作用靶點，針對這一靶點或者蛋白分子研制出具有阻止和抑制心肌重構的藥物或者類蛋白抑制劑，將成為我們進一步研究的動力和目標。

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