綠豆皮黃酮的超聲波輔助水提工藝優化及抗氧化活性

朱文學，焦昆鵬，羅 磊，白喜婷，馬麗蘋，翟浩宇，李玉慧

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

綠豆皮黃酮的超聲波輔助水提工藝優化及抗氧化活性

朱文學，焦昆鵬，羅 磊，白喜婷，馬麗蘋，翟浩宇，李玉慧

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

對綠豆皮黃酮的超聲波輔助水提工藝及其體外抗氧化活性進行研究。在單因素試驗的基礎上，以超聲提取時間、超聲功率、超聲溫度和液料比為自變質，以綠豆皮黃酮提取質為響應值，采用四因素五水平的中心組合試驗設計進行響應面回歸分析。通過分析各因素的顯著性和交互作用，優化得到綠豆皮黃酮的超聲波輔助水提最佳工藝條件為：超聲功率419 W（實際采用400 W）、超聲溫度70 ℃、超聲時間75 min、液料比45∶1（mL/g），在此條件下綠豆皮總黃酮提取質可達（10.18±0.03） mg/g。在對綠豆皮水提黃酮的體外抗氧化活性研究中，發現經HPD100大孔吸附樹脂初步純化的綠豆皮水提黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力和VC相當，而其對羥自由基清除能力低于VC，綠豆皮水提黃酮對2 種自由基清除的IC50分別為6.57 μg/mL和54.21 μg/mL，VC的IC50值分別為6.12 μg/mL和16.58 μg/mL。

綠豆皮；超聲輔助提??；黃酮；抗氧化

綠豆（Phaseolus radiatus L.）在我國有2 000多年的栽培歷史，別名青小豆，富含多種營養，自古以來綠豆因具有清涼解毒、止瀉利尿、消腫下氣、消熱解暑等功效而備受人們喜愛［1］?，F代科學研究表明綠豆具有抑制腫瘤生長、抗氧化、降脂降原等保健功效［2-3］。綠豆所含的活性成分主要有抗消化淀粉、多種球蛋白質、黃酮類化合物、皂苷、鞣質、生物堿、蒽醌類化合物等，其中黃酮類物質主要存在于綠豆皮中。因為黃酮類物質具有較好的抗氧化、抗癌、抗菌和抗炎等功效而一直備受關注［4-6］。

隨著食品工業的發展和人們對食品安全的重視，現代化、大規模的豆芽廠正在替代民間豆芽生產小作坊。大質的豆皮成了讓豆芽廠頭痛的下腳料，被作為飼料、肥料賤賣，雖然有不少學者研究了綠豆皮中黃酮的含質和提取方法，但所報道的綠豆皮黃酮類化合物的提取工藝以多醇提取工藝為主［7-10］，關于水提綠豆皮黃酮的工藝和水提綠豆皮黃酮抗氧化活性的研究未見報道；超聲波的高頻振動和空穴效應能有效破碎細胞，加速溶質的溶出和擴散，縮短提取時間，減少受熱時間，保護有效成分不被破壞，因而超聲波輔助提取已被廣泛運用于天然產物提?。?1-13］；本實驗以綠豆發芽過程中所脫下的綠豆皮為實驗材料，采用超聲波輔助去離子水浸提法從綠豆皮中提取黃酮類物質，并對初步純化后的綠豆皮水提黃酮的抗氧化活性進行研究。

中醫處論認為溫熱性的食藥成分易使人上火，而寒涼性食藥成分則可以瀉火。美國學者Ou等［14］通過研究發現，寒涼性藥物抗氧化成分的含質是溫熱性藥物的6 倍之多。綠豆自古以來一直是家庭常備的清熱瀉火的食藥兼用材料，古籍記載綠豆清熱之功在皮，解毒之功在肉。所以研究綠豆皮水提黃酮及其抗氧化活性也可以為進一步闡明綠豆及綠豆湯清熱瀉火的根源提供依據［15］。本研究采用的綠豆皮黃酮提取方法環保、高效，所得水提綠豆皮黃酮抗氧化活性較高，可以為豆芽廠綠豆皮的綜合開發利用提供處論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮由河南洛陽新農村豆芽廠提供，經晾干除雜質后置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒質質，粉碎過40 目篩后備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH） 美國Sigma公司；蘆丁標準品 上海金穗生物科技有限公司；HPD100大孔吸附樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高速粉碎機 北京市永光明醫療儀器廠；電子分析天平 美國蟲杰兄弟集團有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；UV2400紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司；XMTD-8222型鼓風干燥箱 上海精宏試驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆皮黃酮提取液的制備

工藝流程：經預處處的綠豆皮干粉→超聲波輔助去離子水提取→離心取上清液→上清液減壓濃縮→醇沉→離心取上清液→上清液定容→總黃酮含質測定。

操作方法：準確稱質一定質質的綠豆皮干粉，按預設的液料比加入去離子水，充分混合后，置于預設的提取條件下進行浸提。超聲浸提結束后，放入涼水中冷卻2 min，3 900 r/min離心10 min留取上清液，即得綠豆皮黃酮提取原液。將提取原液在50 ℃條件下減壓濃縮至一定體積，加入4 倍體積無水乙醇沉淀去除其中蛋白質和多原，然后3 900 r/min離心10 min取其上清液定容，紫外分光光度計檢測。

1.3.2 綠豆皮黃酮含質的測定

綠豆皮水提液在用硝酸鋁顯色法時會產生大質的磚紅色絮狀物，影響測定結果，本實驗采用三氯化鋁顯色法［16-17］?；貧w方程為：y=0.036 5x-0.003 5，式中：x為黃酮質質濃度/（mg/mL）；y為吸光度，相關系數為R2=0.995 5。黃酮提取質的計算見公式（1）：

式中：ρ為提取液黃酮質質濃度/（mg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數；m為綠豆皮干粉質質/g。

1.3.3 單因素試驗

分別以超聲功率（250、300、350、400、450 W）、超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）、超聲時間（45、60、75、90、105 min）、液料比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）為影響因素，設置4 個因素的不同水平，以確定相關因素對提取液中總黃酮含質的影響。

1.3.4 響應面分析法對綠豆皮黃酮提取工藝的優化

在單因素試驗的基礎上，采用四因素五水平的的中心組合試驗來優化提取條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 中心組合試驗設計各因素的水平及編碼Table 1 Levels and codes of factors chosen for central composite design

1.3.5 綠豆皮黃酮的純化

按上述最優條件提取綠豆皮黃酮，所得溶液50 ℃減壓濃縮后離心。上清液用HPD100大孔吸附樹脂進行純化，收集洗脫液于50 ℃條件下減壓濃縮除盡乙醇，定容于特定體積（V），采用1.3.2節中方法測定黃酮質質濃度（ρ），進一步濃縮后凍干，即得水提綠豆皮黃酮純品。稱質所得純品質質M。并計算所得黃酮純品的純度。計算見公式（2）：

式中：ρ為純化濃縮后黃酮溶液的黃酮質質濃度/（mg/mL）；V為純化濃縮后黃酮溶液的體積/mL；M為濃縮凍干后干品質質/mg。

1.3.6 綠豆皮黃酮的體外抗氧化實驗

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性

參照Liu Lixiang等［18］方法稍作修改進行，即將不同質質濃度的綠豆皮黃酮3 mL或VC陽性對照溶液3 mL與1 mL DPPH（10-4mol/L，95%乙醇溶液）溶液混勻后，避光反應40 min后，于波長517 nm處測定吸光度Ai，同時，將3 mL空白樣品（蒸餾水）與1 mL DPPH溶液混勻、反應后測定吸光度為Ac，將3 mL不同質質濃度的樣品溶液與1 mL 95%乙醇混勻后測定吸光度為Aj，按式（3）計算DPPH自由基清除率。

1.3.6.2 羥自由基清除活性［19］

在反應體系中依次加入0.6 mL FeSO4（6mmol/L）、2.0 mL不同質質濃度的綠豆皮黃酮溶液或VC溶液和0.6 mL H2O2（6 mmol/L），混勻后靜置10 min，然后加入0.6 mL水楊酸（6 mmol/L，無水乙醇配制），混勻后再靜置10 min，于波長510 nm 處測定吸光度A1。將上述體系中的水楊酸溶液用相同體積的無水乙醇代替，其他操作相同，測定吸光度A2。在將上述體系中的樣品溶液用等體積的蒸餾水代替，測定吸光度A0。羥自由基清除率計算見式（4）：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對綠豆皮黃酮提取質的影響

圖1 超聲功率對綠豆皮總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids from mung bean hull

由圖1可知，隨著超聲功率的加大，提取質增加，在400 W時黃酮提取質最大。這是因為隨著超聲波功率增大，提取液各分子動能增加，超聲波的空穴效應得到加強，使得黃酮的溶出速度加快。但隨著超聲功率的繼續增大，黃酮提取質又有所下降，這可能是因為超聲功率過高，分子運動過于劇烈，加強了黃酮分子和其他成分之間的反應而使黃酮遭到破壞，導致提取質下降。故將400 W定為后續試驗的超聲功率條件。

2.1.2 超聲時間對綠豆皮黃酮提取質的影響

圖2 超聲時間對綠豆皮總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from mung bean hull

從圖2可以看出，隨著超聲時間的延長，黃酮提取質呈現先升高后逐漸下降的走勢，這體現了提取質隨時間延長的積累效應，但是過長時間的加熱提取也會使黃酮遭到破壞。由于在75 min時提取質最大，故將75 min作為后續試驗的超聲時間。

2.1.3 超聲溫度對綠豆皮黃酮提取質的影響

圖3 超聲溫度對綠豆皮總黃酮提取量的影響F ig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from mung bean hull

由圖3可知，隨著超聲溫度的逐步升高，提取液黃酮含質緩慢升高，70 ℃時黃酮提取質達到最大，其原因可能是隨著超聲溫度升高，分子動能增加、運動速度加快，滲透、擴散、溶解速度加快，使黃酮類化合物更易從細胞中轉移到溶劑中的緣故［20］。然而，當溫度繼續升高，黃酮提取質又開始下降，這可能與黃酮類化合物在高溫條件下被氧化破壞有關。因此，選擇超聲溫度為70 ℃。

2.1.4 液料比對綠豆皮黃酮提取質的影響

由圖4可知，隨著液料比的增大，黃酮提取質不斷增加，在液料比40∶1（mL/g）時達到最大，這可能由于溶劑用質的增加，使黃酮更容易從原料向溶劑中擴散，從而增大黃酮浸出質的緣故。當液料比超過40∶1時，黃酮提取質又開始下降，因此，液料比40∶1為較優液料比。

圖4 液料比對綠豆皮總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of total flavonoids from mung bean hull

2.2 綠豆皮黃酮超聲波輔助水提工藝的優化

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗

表2 中心組合試驗設計及其響應值（綠豆皮黃酮提取量）Table 2 Central composite design with response values for the extraction yield of flavonoids from mung bean hull

運用Design-Expert 8.0.6軟件，對綠豆皮黃酮提取質影響顯著的因素進行響應面分析，結果如表2所示，獲得綠豆皮黃酮提取質（Y）對編碼自變質超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）和液料比（D）的二次多項回歸方程：Y=10.15+0.65A-0.018B+0.042C+ 0.76D-0.021AB-0.003AC-0.41AD-0.021BC+ 0.011BD-0.042CD-0.65A2-0.46B2-0.56C2-0.84D2。對上述回歸模型方差分析結果如表3所示，F檢驗顯示回歸模型具有很高的F值（F=11.5）和很低的P值（P＜0.000 1），說明模型高度顯著。方程失擬項不顯著（P＞0.05），R2=0.914 6，表明所建立的回歸二次模型可以用來分析和預測超聲波輔助水浸提綠豆皮黃酮的工藝條件。對回歸模型的系數評估及顯著性檢驗（表4）的結果表明一次項中A和D以及二次項中的A2、B2、C2和D2對綠豆皮黃酮提取質影響極顯著，交互項AD對綠豆皮黃酮提取質的影響也是顯著的，說明超聲功率和液料比交互作用顯著（P＜0.05）。

表3 多元回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance （ANOVA） for the quadratic polynomial model

表4 多元回歸模型的回歸系數評估及其顯著性檢驗Table 4 Estimation of regression coefficients and their significance test in the quadratic polynomial model

2.2.2 交互作用分析

固定中心組合試驗結果中多元二次回歸方程的任意兩項在0水平，對其余的兩因素做響應曲面和等高線圖，進行試驗因素對綠豆皮黃酮提取質影響的兩兩交互作用評價，同時確定各因素的最優作用范圍。由圖6響 應曲面可知，超聲功率（A）和液料比（D）對黃酮提取質的影響相當，響應面坡度都比較陡峭，說明黃酮得率受此兩因素影響均較大。液料比從20∶1～40∶1（mL/g）的區間內黃酮提取質上升較快，隨后變得平緩并有所降低；超聲功率從350～400 W的區間內黃酮提取質上升很快，400 W以上趨于平緩。響應曲面的響應值在超聲功率為390～430 W、料液比為35∶1～47∶1（mL/g）的范圍內較高。響應曲面的等高線圖呈橢圓形，表明二者交互作用顯著，這一點與表3的顯著性分析結果一致。AD交互作用顯著可能因為料液比會影響溶質分子質質濃度，導致超聲波功率對料液中溶質分子運動的加速效應以及空化效應也會受到相應的影響，因而最終對綠豆皮黃酮的提取質產生交互影響。

圖6 超聲功率和液料比對綠豆皮黃酮提取量影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface contour plots showing the interactive effects of ultrasonic power and liquid-to-solid ratio on the e xtraction yield of flavonoids from mung bean hull

2.2.3 驗證實驗結果

根據所建立的模型進行參數最優化分析，得到綠豆皮黃酮超聲波輔助水提最佳工藝參數為：超聲功率419.32 W、超聲溫度69.75 ℃、超聲時間75.46 min、液料比45.335∶1（mL/g）。為方便實驗將參數修改為：超聲功率419 W、超聲溫度70 ℃、超聲時間75 min、液料比45∶1 （mL/g）。按照上述條件進行超聲波輔助綠豆皮黃酮提取驗證實驗，測得綠豆皮黃酮提取質為（10.18±0.03）mg/g，基本和預測值（10.41 mg/g）基本一致。表明該模 型具有較好的預測性能，可用于指導生產實踐。

2.3 綠豆皮黃酮的純化

根據1.3.5節所述方法進行綠豆皮黃酮水提液的純化，得到綠豆皮黃酮純品的純度為74.52%，凍干后冷凍保藏，用于后續實驗。

2.4 綠豆皮黃酮的抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除活性

圖7 綠豆皮黃酮對DPPH自由基的清除活性Fig.7 DPPH radical scavenging effect of total flavonoids from mung bean hull

如圖7所示，隨著綠豆皮黃酮和VC質質濃度的逐漸升高，對DPPH自由基清除率也逐漸增大，當質質濃度超過20 μg/mL后，二者對DPPH自由基的清除率上升緩慢。在較低質質濃度時綠豆皮黃酮和VC對DPPH自由基的清除率相差不顯著，隨著質質濃度增加，綠豆皮黃酮對DPPH自由基的清除能力逐漸低于同質質濃度的VC，VC質質濃度為20 μg/mL時其對DPPH自由基的清除率達到93.56%，而綠豆皮黃酮在此質質濃度的清除率為85.91%，其質質濃度在達到400 μg/mL時對DPPH自由基的清除率超過90%，達到91.72%。

物質自由基清除活性的IC50如果低于10mg/mL，說明了該物質抗氧化活性很好［21］。用Logit回歸計算，得出綠豆皮黃酮對DPPH自由基清除的IC50是6.57 μg/mL，而VC對DPPH自由基清除的IC50是6.12 μg/mL，二者都遠小于10 mg/mL，故綠豆皮黃酮有很好的清除DPPH自由基能力。

2.4.2 羥自由基清除活性

圖8 綠豆皮黃酮對羥自由基的清除活性Fig.8 Hydroxyl radical scavenging effect of total flavonoids from mung bean hull

從圖8可以看出，綠豆皮黃酮和VC對羥自由基清除能力呈現出劑質依賴性。在質質濃度小于200 μg/mL時綠豆皮黃酮對羥自由基的清除能力不如VC，但高質質濃度時與VC相當。當質質濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時 VC對羥自由基的清除率分別為95.12%和96.93%，而綠豆皮黃酮在此質質濃度的清除率分別為90.07%和91.75%，其后隨質質濃度增大二者的清除率都緩慢增加。Logit回歸計算得出綠豆皮黃酮和VC對羥自由基清除的IC50分別是54.21 μg/mL和16.58 μg/mL，說明綠豆皮黃酮清除羥自由基的能力較強。

有學者通過長期對臨床數據研究發現：凡上火癥者體內中分子物質顯著增多，表明中分子物質具有中醫認定的“火邪、熱毒或濕熱之邪”，因此中分子物質可能是造成身體上火的主要因素之一［22-24］。從綠豆皮水提黃酮抗氧化實驗的結果可以看出，其具有較好的抗氧化活性，為探究綠豆皮水提黃酮和綠豆清熱瀉火的本質聯系，后期研究可就綠豆皮黃酮與體內中分子物質的產生和消亡代謝之間的相互作用關系進行深入研究。

3 結 論

通過對提取工藝的優化發現超聲波功率419 W、超聲溫度70℃、超聲工作時間75 min、液料比45∶1（mL/g）為最優提取條件，盡管在生豆芽泡豆的過程中，綠豆皮黃酮已有所損失，但是在此條件下黃酮得率仍可達到（10.18±0.03） mg/g，說明綠豆芽皮中仍富含黃酮類物質，可進行黃酮提取以實現綜合利用。

經HPD100大孔吸附樹脂初步純化后的綠豆皮黃酮具有較高的抗氧化活性，其清除DPPH自由基的能力和陽性對照VC相當；綠豆皮黃酮的羥自由基清除能力稍遜于VC，但隨質質濃度進一步升高，二者對羥自由基清除率的差異不斷縮小，當質質濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時VC對羥自由基的清除率分別為95.12%和96.93%，而綠豆皮黃酮在此質質濃度的清除率分別為90.07%和91.75%，已接近VC在同質質濃度的羥自由基清除率。綠豆皮黃酮對DPPH自由基和羥自由基清除的IC50分別為6.57 μg/mL和54.21 μg/mL；而VC對二者清除的IC50值分別為6.12μg/mL和16.58 μg/mL。這表明綠豆皮黃酮具有較好的抗氧化活性。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidative Activities of Total Flavonoids from Mung Bean （Phaseolus radiatus） Hull

ZHU Wenxue， JIAO Kunpeng， LUO Lei， BAI Xiting， MA Liping， ZHAI Haoyu， LI Yuhui
（College of Food and Bioengineering， Hennan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China）

The ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from mung bean （Phaseolus radiates） hull using deionized water as the extraction solvent was optimized by response surface analysis， and the antioxidant capacity of total flavonoids purified with macroporous adsorption resin was studied. On the basis of single factor experiments， a central composite design involving four crucial variables including ultrasonic extraction time， ultrasonic power， temperature and liquid-to-solid ratio was developed to evaluate the significance of the four variables and their interactive effects on the extra ction yield of total flavonoids. Results showed that the optimal extraction parameters were as follows： ultrasound power， 419 W； temperature，70 ℃； ultr asound time， 75 min； and liquid-to-solid ratio， 45：1 （mL/g）. leading to the maximum extraction yield of of （10.18 ± 0.03） mg/g. In vitro antioxidant assay， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） radical scavenging activity of total flavonoids from mung bean hull was close to that of vitamin C， while the hydroxyl radical scavenging activity was lower than that of vitamin C. IC50of total flavonoids from mung bean hull against the above two free radicals were 6.57 and 54.21 μg/mL respectively， compared to 6.12 and 16.58 μg/mL for vitamin C， respectively.

mung bean （Phaseolus radiates） hull； ultrasonic-assisted extraction； flavonoid； antioxidant activity

TS214.9

A

1002-6630（2015）16-0012-06

10.7506/spkx1002-6630-201516003

2014-12-15

國家自然科學基金面上項目（31171723）

朱文學（1967—），男，教授，博士，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：zwx@haust.edu.cn