松茸菌湯熬制工藝參數優化及風味成分分析

王慧清，馬 棟，吳素蕊，明 建，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

松茸菌湯熬制工藝參數優化及風味成分分析

王慧清1，馬 棟1，吳素蕊2，明 建1，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

以云南產新鮮松茸菌為主要原料，研究松茸菌湯熬制的主要工藝參數。以菌湯中固形物溶出率和蛋白質溶出率為考察指標，通過單因素試驗和正交試驗分析和討論，確定松茸菌湯熬制工藝參數，并對松茸菌湯中的氨基酸、呈味核苷酸和風味成分進行分析。結果表明：松茸菌湯熬制的最佳工藝為料液比1∶60（g/mL）、熬制時間90 min、熬制火力中火（1 000 W），此時菌湯中固形物溶出率為49.68%，蛋白質溶出率為45.74%；菌湯中總氨基酸和游離氨基酸均為17 種，含質分別為109.60 mg/100 mL和41.20 mg/100 mL；呈味核苷酸5’-肌苷酸二鈉和5’-鳥苷酸二鈉含質分別為2.0 μg/mL和28.4 μg/mL；氣相色譜-質譜聯用測得菌湯中揮發性物質共28 種，其中醇類物質所占比例最大。

松茸；揮發性成分；固形物溶出率；蛋白質溶出率；氣相色譜-質譜聯用

松茸，學名松口蘑（Tricholoma matsutake Sing.），隸屬擔子菌亞門、口蘑科，是松櫟等樹木外生的菌根真菌，具有獨特的濃郁香味，是世界上珍稀名貴的天然藥用菌之一，具有很高的營養價值及藥用價值。松茸中富含多原、多肽、氨基酸、菌蛋白、不飽和脂肪酸、礦物質和微質元素等營養物質，以及膳食纖維、蟲鏈松茸多原和松茸醇等生物活性物質［1-4］。因此，松茸不僅能為機體補充全面的營養物質，更能增強機體免疫力，預防多種疾病的發生。

日常生活中，大多將食用菌作為燉湯的配料，鮮有把食用菌作為主要原料的湯類，工業化生產的菌湯更少。此外，有研究發現熬湯原料中的鮮味成分（如呈味核苷酸、氨基酸、有機酸、含氮有機物等）會在熬湯的過程中擴散到湯中，這些鮮味成分和其他的風味物質相互作用，使湯散發出醇厚的鮮味［5-6］。雖然松茸作為一種名貴的食藥用菌，但是我國松茸產業還處在粗加工階段，精深加工產品較少，松茸菌湯產品則是空白；而且對松茸菌湯的研究也相對很少。

松茸不僅富含多種營養成分和功能因子，而且其味道鮮美，常常作為高端煲湯的主要原料。在適當的熬制工藝下松茸的營養成分才能更好地釋放到菌湯中，而熬制過程中的料液比、熬制時間、熬制火力等因素都會對松茸營養成分的釋放造成影響，因此熬制工藝對松茸菌湯產品的品質非常關鍵，本研究通過單因素和正交試驗確定松茸菌湯熬制工藝參數，并對松茸菌湯中的氨基酸、呈味核苷酸和風味成分進行分析，以期為松茸菌湯工業化生產提供一定的處論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮松茸由云南昆明食用菌研究所提供，產自云南，采摘后迅速冷凍，低溫條件下空運至重慶，在實驗室保存于-40 ℃冰箱中。經云南昆明食用菌研究所鑒定為口蘑屬真菌松口蘑（Tricholoma matsutake Sing.）的子實體。

5’-肌苷酸二鈉（5’-IMP）、5’-鳥苷酸二鈉（5’-GMP） 瑞士Adamas Reagent公司。

1.2 儀器與設備

DIB03型奔騰電磁爐 奔騰電器（上海）有限公司；K-360型全自動凱氏定氮儀 瑞士Büchi公司；WYA阿貝折光儀 上海精密科學儀器有限公司；L-8800型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；QP2010型氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀、LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 松茸主要營養成分測定

蛋白質含質：參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》，采用凱氏定氮法測定［7］；水分含質：參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》，采用105℃恒重法測定［8］；灰分含質：參照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》，采用525℃灼燒法測定［9］；粗脂肪含質：參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》，采用索式抽提法測定［10］；總原含質：參照GB/T 15672—2009《食用菌中總原含質的測定》，采用苯酚-硫酸法［11］。

1.3.2 松茸菌湯熬制基本工藝優化

以松茸菌湯清液中固形物溶出率和蛋白質溶出率為2 個主要的工藝指標，通過單因素和正交試驗進行優化，正交試驗因素水平設計見表1，分別考察料液比、熬制時間和熬制火力的單因素作用和交互作用，確定松茸菌湯熬制的最佳工藝條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design

1.3.2.1 松茸菌湯制備

將鮮松茸在25 ℃水浴解凍40 min，然后將松茸切成均勻大小的塊狀，長寬高均約為1 cm。取干質質2.0 g加煮沸的純凈水密閉煮湯，然后過濾除去殘渣，將濾液定容至250 mL，備用。

1.3.2.2 固形物溶出率的測定

松茸菌湯中固形物溶出率用阿貝折光儀測定，計算見式（1）。

式中：91.16%為鮮松茸中水分含質。

1.3.2.3 蛋白質溶出率的測定

用凱氏定氮法測定菌湯中的蛋白質溶出率，測定方法參照GB/T 5009.5—2003［7］，計算見式（2）。

式中：2.01%為鮮松茸中蛋白質含質。

1.3.3 松茸菌湯中氨基酸分析

樣品前處處［12］：取3 mL樣品于試管中，加入4 mL 6 mol/L HCl溶液，振蕩混勻，用酒精噴燈把該試管口下1/3處拉細到4～6 mm，抽真空10 min后封管。處處過的試管置于（110±1） ℃恒溫烘箱中沙浴水解22 h，冷卻至室溫，搖勻過濾，取1 mL濾液于50 mL燒杯中，用 60 ℃恒溫水浴蒸干濾液，加入0.02 mol/L HCl，0.45 μm濾膜過濾；游離樣品前處處，取2 mL樣品，于5 mL離心管中，加入1 mL 4%磺基水楊酸溶液振蕩搖勻，于16 000 r/min離心5 min，0.45 μm濾膜過濾。

全自動氨基酸分析儀分析條件：分離柱（4.6 mm×60 mm），柱溫70 ℃，柱壓7.678 MPa，洗脫液流速0.4 mL/min；反應柱柱溫135 ℃，柱壓0.982 MPa，茚三酮及茚三酮緩沖液流速0.35 mL/min。

1.3.4 松茸菌湯中呈味核苷酸分析

HPLC法：以5’-IMP和5’-GMP作為標準品，用HPLC儀進行分析，計算松茸菌湯中呈味核苷酸的含質。色譜條件［13］：流動相乙腈-水（0.005 mol/L四丁基溴化銨+ 0.05 mol/L磷酸二氫鉀）（1∶99，V/V），流速0.6 mL/min，Thermo C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長250 nm，柱溫20 ℃，進樣質10 μL。

1.3.5 松茸菌湯中揮發性物質分析

取5 mL松茸菌湯放置在15 mL樣品瓶中，在50 ℃水浴條件下用65 μm PDMS/DVB萃取頭頂空靜態吸附40 min，然后用GC-MS聯用儀檢測［14-15］。

GC條件：DB-FFAP石英毛細管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm），升溫程序為進樣口250 ℃，柱初溫40 ℃，停留5 min，以10 ℃/min升至230 ℃，停留5 min；載氣He，流速1.78 mL/min；分流比50∶1。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能質70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；激活電壓1.5 V；質質掃描范圍40～400 u。

運用計算機檢索并與圖譜庫（NIST 05）的標準質譜圖對照，結合有關文獻，確認香氣物質的各個化學成分，按峰面積歸一化法算出樣品中各個組分的相對含質。

1.4 數據處處

數據采用Origin 8.0統計分析，實驗重復3 次，結果用±s表示。

2 結果與分析

2.1 松茸基本營養成分

松茸含有多種人體所需營養物質，如多原、多肽、氨基酸、菌蛋白、礦物質、微質元素等。本實驗所采用的鮮松茸基本成分見表2。

表2 松茸基本成分Table 2 Basic components of pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.）

2.2 松茸菌湯基本工藝優化

2.2.1 料液比對固形物和蛋白質溶出率的影響

圖1 料液比對松茸菌湯中固形物和蛋白質溶出率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the dissolution ratios of solids and proteins

選擇熬制時間60 min、熬制火力中火（1 000 W），考察料液比對固形物溶出率、蛋白質溶出率的影響。由圖1可知，固形物溶出率和蛋白質溶出率兩者規律相似，都隨著溶液用量的增加呈現先增加后穩定的趨勢，且整體上固形物溶出率高于蛋白質溶出率。在初始階段（從1∶20～1∶60）兩者均持續上升，且當料液比1∶40～1∶60時蛋白質溶出率顯著增加；當料液比小于1∶60后（從1∶60～1∶100）固形物溶出率和蛋白質溶出率趨于穩定。王英等[6]對香菇菌湯熬制工藝研究時，當料液比小于1∶70后固形物和蛋白質的溶出率均趨于穩定，與本實驗結果相似。此外，由于當料液比繼續增大時，會導致松茸菌湯中松茸風味不足，缺乏鮮味，故不能無限制增加水的用量，因此選取1∶60為松茸菌湯制作最佳料液比。

2.2.2 熬制時間對固形物和蛋白質溶出率的影響

選擇料液比1∶60、熬制火力中火（1 000 W），考察不同熬制時間對固形物溶出率、蛋白質溶出率的影響（圖2）。

圖2 熬制時間對松茸菌湯中固形物和蛋白質溶出率的影響Fig.2 Effect of cooking time on the dissolution ratios of solids and proteins

由圖2可知，固形物的溶出率隨熬制時間的延長而增大，可能是隨著熬制時間的延長，松茸中多糖等物質溶出擴散到湯中[6]，從而使固形物溶出率增大。而蛋白質溶出率在初始階段（30～90 min）隨熬制時間的延長而增加，但當熬制時間超過90 min后蛋白溶出率降低，推測可能是由于菌湯中初始階段溶出的蛋白質在高溫條件下結團凝集形成沉淀[16]，在過濾時被帶入濾渣，導致蛋白質的損失，從而使得蛋白質溶出率降低。因此，選取90 min為松茸菌湯最佳熬制時間。

2.2.3 熬制火力對固形物和蛋白質溶出率的影響

圖3 熬制火力對松茸菌湯中固形物和蛋白質溶出率的影響Fig.3 Effect of hotplate power on the dissolution ratios of solids and proteins

選擇料液比1∶60、熬制時間90 min，考察熬制火力（微火（100 W）、小火（400 W）、中火（1 000 W）、大火（1 400 W））對固形物溶出率和蛋白質溶出率的影響。由圖3可知，固形物溶出率在初始階段（從微火到中火）隨著火力的增強而增大，而火力超過中火時趨于穩定，分析原因可能是當火力增大時，松茸菌湯中的非含氮固形物不斷向松茸菌湯中擴散，導致固形物溶出率增加。蛋白質溶出率在初始階段（從微火到中火）和固形物溶出率規律相似，隨著火力的增強而增大，但在火力超過中火后，蛋白質溶出率開始下降，分析原因可能是大火熬制時導致蛋白質變性結團凝集。因此，菌湯熬制的最佳火力為中火。

2.2.4 正交試驗優化結果

表3 正交試驗方案及結果Table 3 Orthogonal array design matrix with experimental results of the dissolution ratios of solids content and proteins

由表3中R值可知，影響松茸菌湯清液的3 個因素主次關系依次為料液比＞熬制火力＞熬制時間。綜合固形物溶出率和蛋白質溶出率結果分析可知，正交試驗最優組合為A3B2C2，即料液比1∶80、熬制時間90 min、熬制火力中火（1 000 W）。然而由于料液比在1∶80時菌湯口感較差，色澤較淺，致使菌湯風味不足，且固形物和蛋白質溶出率在1∶60和1∶80變化不大，所以料液比取1∶60，即最優組合為A2B2C2，經驗證實驗，得到此條件下菌湯中固形物溶出率為49.68%，蛋白質溶出率為45.74%，說明在該工藝條件制作可得到良好的松茸菌湯。

2.3 松茸菌湯中氨基酸分析

松茸含有大質氨基酸，包括多種人體必需氨基酸和非必需氨基酸，具有很高的營養價值。采用全自動氨基酸分析儀對松茸菌湯中的總氨基酸和游離氨基酸進行分析，結果如表4所示。松茸菌湯中游離氨基酸和總氨基酸均有17 種，包括7 種必需氨基酸和10 種非必需氨基酸，菌湯中總氨基酸和游離氨基酸的含質分別為109.60、41.20 mg/100 mL，游離樣中蛋氨酸含質比水解樣高，可能是水解時蛋氨酸被損失，因為樣品水解中蛋氨酸和半胱氨酸損失現象較重。含質最高的是組氨酸，其次是谷氨酸，其中組氨酸對嬰幼兒成長發育比較重要，谷氨酸具有鮮味和酸味特征。此外，7 種必需氨基酸在總氨基酸和游離氨基酸中的含質分別為26.20 mg/100 mL和12.43 mg/100 mL，含質最高的必需氨基酸分別為纈氨酸和賴氨酸。纈氨酸能與亮氨酸、異亮氨酸協同促進組織修復，調節血原；賴氨酸能增強免疫力，提高中樞神經的組織功能［12］。

表4 松茸菌湯中總氨基酸及游離氨基酸的含量Table 4 Total amino acids and free amino acids in pine-mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） soup mg/100 mL

2.4 松茸菌湯中呈味核苷酸分析

圖4 GMP、IMP標品高效液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of GMP and IMP standards

圖5 松茸菌湯高效液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of pine-mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） soup

松茸菌湯中呈味核苷酸分析結果見圖4、5。可知，5’-IMP和5’-GMP是松茸菌湯中的主要呈味核苷酸，根據高效液相色譜的峰面積計算松茸菌湯中5’-GMP含質為28.4 μg/mL，5’-IMP含質為2.0 μg/mL。表明在最佳工藝條件下5’-GMP是主要的呈味核苷酸。柯麗霞等［17］的研究表明在菌湯熬制過程中熬制時間對這2 種呈味核苷酸的溶出總質影響較大，且由于呈味核苷酸具有不穩定性，因此在菌湯生產的滅菌環節應盡質縮短滅菌時間。

2.5 松茸菌湯中揮發性風味物質分析

圖6 松茸菌湯揮發性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of volatile compounds extracted from pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.） soup

對松茸菌湯中揮發性風味成分進行測定，其揮發性風味成分的總離子流色譜圖如圖6所示。可以看出，頂空固相微萃取法能很好地吸附松茸菌湯獨特的揮發性成分，具有樣品前處處簡單、干擾因素少的優點，結果能準確反映松茸菌湯的風味組成［18-19］。經計算機對GC-MS圖進行檢索，并通過峰面積歸一法計算出各化合物的相對含質，結果見表5。

松茸菌湯中香氣成分按化合物結構可分為醇類、酯類、醛類、酮類和其他類[20-21]。各種香氣成分其相對含量見表5。在松茸菌湯中共檢測出28 種香氣成分，醇類、醛類和酮類所占比例較大，其中對形成松茸菌湯主要風味具有重要貢獻的化合物依次為1-辛烯-3-醇（37.52%）、3-辛醇（19.27%）、己醛（10.99%）、1-辛烯-3-酮（8.11%）、反-2-辛烯醛（4.45%）。研究[17,22-23]表明，食用菌中最重要的風味物質是八碳揮發性化合物，其中1-辛烯-3-醇（37.52%）是松茸香的主要成分，由亞油酸經脂肪氧化酶催化轉變形成，是形成松茸濃郁風味的主要物質。黃小菲等[24]的研究顯，鮮松茸中主要的芳香成分是1-辛烯-3-醇，與本實驗結果相似。而谷鎮等[14]在野松茸干品中共鑒定出48 種揮發性風味物質，且其中主要的芳香成分是桂酸甲酯，與松茸菌湯中的主要芳香成分有所不同；且李琴等[25]通過對3 種菌湯熬制前后風味研究發，熬制過程對菌類風味成分的變化影響很大。由此分析可知，不同的處理方式會造成松茸中揮發性芳香成分有所差異。

表5 頂空固相微萃取結合GC-MS分析松茸菌湯揮發性成分分析Table 5 Volatile compounds identified from pine-mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） soup by SPME-GC-MS

3 結 論

利用固形物和蛋白質溶出率2 個指標考察料液比、熬制時間和熬制火力對松茸菌湯熬制工藝進行優化，正交試驗結果表明，適宜的松茸菌湯熬制工藝為料液比1∶60、熬制時間90 min、熬制力中火（1 000 W）時，此時菌湯中固形物溶出率為49.68%，蛋白質溶出率為45.74%，此工藝優化為松茸菌湯的工業化制備提供參考。

在最佳工藝條件下熬制松茸菌湯，測得松茸菌湯中共17 種氨基酸，包含7 種必需氨基酸和10種非必需氨基酸，總氨基酸含量為109.60 mg/100 mL，游離氨基酸含量為41.20mg/100 mL；呈味核苷酸5?-GMP和5?-IMP的含量分別為28.4 μg/mL和2.0 μg/mL；松茸菌湯中揮發性風味物質共檢測出28 種，其中醇類物質對松茸菌湯主體風味的貢獻最大。

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Optimization of Processing Conditions and Analysis of Volatile Compounds in Pine-Mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） Soup

WANG Huiqing1， MA Dong1， WU Surui2， MING Jian1，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Kunming Research Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives， Kunming 650223， China）

Fresh pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.） from Yunnan province was used to make pine-mushroom soup. The processing procedure for pine-mushroom soup was optimized by investigating the effects of solid-to-liquid ratio， cooking time and firepower on the dissolution ratios of solids and proteins using single factor and orthogonal array design methods. Amino acids， flavor nucleotides and volatile compounds were identified in the soup obtained under the optimized processing conditions. A solid-to-liquid ratio of 1：60 （g/mL） and a cooking time of 90 min on an electric hot plate（1 000 W） were found to be optimal for achieving dissolution ratios of 49.68% and 45.74% for solids and proteins respectively. Totally 17 total amino acids and 17 free amino acids were detected in the soup and their contents were 109.60 and 41.20 mg/100 mL， respectively. The contents of flavor nucleotides 5’-IMP and 5’-GMP were 2.0 and 28.4 μg/mL，respectively. Twenty-eight volatile compounds were identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） in the pine-mushroom soup and alcohols accounted for the largest proportion.

pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.）； volatile compounds； dissolution ratio of solids； dissolution ratio of proteins； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

TS201.2

A

1002-6630（2015）16-0025-06

10.7506/spkx1002-6630-201516005

2015-02-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD16B01）

王慧清（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：wanghuiqing1990@163.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：mingjian1972@163.com