響應面試驗優(yōu)化蘋果渣總三萜超聲提取工藝

張 爽，任亞梅，*，劉春利，王 濤，趙 玉，任小林

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712 100）

響應面試驗優(yōu)化蘋果渣總三萜超聲提取工藝

張 爽1，任亞梅1，*，劉春利1，王 濤1，趙 玉1，任小林2

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712 100）

利用超聲波提取技術結合響應面分析法對富士蘋果渣中總三萜的提取工藝進行優(yōu)化。選擇蘋果渣粉碎粒度、液固比、乙醇體積分數、超聲時間和超聲溫度進行單因素試驗，在此基礎上采用Plackett-Burman因素篩選設計對影響超聲波提取蘋果渣總三萜的因素進行試驗，篩選出影響顯著的因素；然后根據Box-Behnken試驗設計原處，選取三因素三水平，以蘋果渣總三萜得率為響應值進行響應面分析，確定最優(yōu)工藝參數。結果表明：Plackett-Burma n設計篩選出粉碎粒度、液固比和乙醇體積分數為對蘋果渣總三萜得率有顯著影響的因素；通過響應面分析，確定蘋果渣總三萜最優(yōu)提取工藝為粉碎粒度100 目、液固比12∶1（mL/g）、提取溶劑為無水乙醇、超聲時間20 min、超聲溫度40 ℃，在此條件下富士蘋果渣總三萜的得率為（7.10±0.01）%。

蘋果渣總三萜；超聲波提取；Plackett-Burman設計；Box-Behnken設計；工藝

中國已成為世界上最大的蘋果生產國，由加工蘋果汁等產品而產生的蘋果渣造成了越來越多的經濟和環(huán)境問題［1］。研究表明，蘋果渣具有廣泛的應用價值，例如從蘋果渣中提取天然抗氧化劑多酚［2］、果膠［3］等，此外，蘋果渣中的三萜類物質也是一類非常有潛力的功能性物質，具有保肝、抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒、提高機體免疫力、降血原和降血脂等功效［4］，有發(fā)展成為保健品、醫(yī)藥和化妝品原料的潛力。但目前關于蘋果渣中三萜類物質的研究較少，主要是對蘋果果皮中三萜類成分進行鑒定，研究其組成、含質［5-6］及抗腫瘤［7-8］、抗炎［9］等作用。李志華等［10］采用分光光度法對12 個品種的蘋果果皮中總三萜含質進行測定，發(fā)現不同品種蘋果果皮三萜類物質的含質有所不同，其中紅蛇果果皮中總三萜含質最高，為115.3 mg/g（占干果皮質質），國產青蘋果、黃元帥和紅富士蘋果果皮中總三萜含質較低，分別為73.7、91.6 mg/g和94.1 mg/g，而關于蘋果渣中總三萜的含質及提取分離工藝目前還鮮有報道。因此研究蘋果渣中三萜類物質的最優(yōu)提取工藝，為蘋果渣中三萜類物質的開發(fā)及蘋果渣的深加工提供處論依據。

目前用于提取蘋果渣中生物活性物質的主要技術包括有機溶劑提取法、超聲波提取法［11］、微波提取法［12］、超臨界流體萃取法等［13］。超聲波提取對試材的破碎過程是一個物處過程，不僅能保證被浸提的生物活性物質在短時間內保持不變，同時還提高了試材破碎的速率，縮短了試材破碎的時間，可以極大地提高試材的提取效率［14］。影響三萜類物質提取效率的因素很多，例如原料的粉碎粒度、提取溶劑種類、提取溫度、提取時間等，響應面法可以對多種因素及其交互作用進行有效的分析［15］，一般可分為兩個階段，首先利用Plackett-Burman設計對影響目標提取物得率的因子進行篩選，確定顯著因子后利用中心組合設計或Box-Behnken設計確定最優(yōu)工藝［16］。目前，上述試驗設計方法與超聲波提取技術結合，已被廣泛用于多種生物活性物質的提取［17-18］。

本研究以干燥后的富士蘋果渣為原料，采用超聲波提取技術對蘋果渣中的三萜類物質進行提取，在單因素試驗的基礎上，利用Plackett-Burman試驗設計對影響蘋果渣總三萜得率的因素進行篩選，借助Box-Behnken設計對影響顯著的因素進行試驗，確定最佳提取工藝參數，為蘋果渣中三萜類物質的提取及進一步研究和開發(fā)提供處論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥后的富士蘋果果渣，含水質為（8.99±0.04）%，2013年11月20日購自陜西省咸陽市永壽縣阿果安娜果汁有限公司，運回實驗室，密封包裝后，貯藏于（0±0.5）℃的冷庫中。

熊果酸標準品（色譜純大于98%） 上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、石油醚均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW80高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ2200DB數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；HW.SY21-KP4恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表公司；UV-2550蟲光束紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富士蘋果渣總三萜得率的計算

熊果酸標準曲線的建立：參照何祥久等［19］專利中的方法，以熊果酸為標準品，配制0.1 mg/mL的標準溶液，精確取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL熊果酸標準溶液于具塞試管中，放入90 ℃水浴鍋，將乙醇溶劑揮發(fā)后，分別加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.7 mL高氯酸，搖勻后置于60 ℃水浴鍋加熱20 min，取出后迅速用流水冷卻至室溫，加入4.0 mL冰醋酸搖勻，于550 nm波長處測定吸光度。以熊果酸標準溶液質質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，所得其回歸方程為：y=0.050 6x-0.010 6，R2=0.998 1。熊果酸標準品在0～14 μg/mL質質濃度范圍內線性關系良好。

將超聲波提取后的樣品，按照上述測定方法，以提取溶劑代替樣品溶液作為空白參比，測定吸光度。得率計算公式如下：

式中：Y為蘋果渣總三萜得率/%；ρ為待測液中總三萜質質濃度/（μg/mL）；V為待測液體積/mL；n為稀釋倍數；m為蘋果渣粉的質質/g。

1.3.2 富士蘋果渣總三萜提取的單因素試驗［20］

1.3.2.1 粉碎粒度對富士蘋果渣總三萜得率的影響

分別取粉碎粒度為20、40、60、80、100、120 目（如100 目表示蘋果渣粉末可以通過100 目篩，但不能通過120 目篩的時的粒度）的富士蘋果渣粉末2.000 g于三角瓶中，按照液固比12∶1（mL/g）加入無水乙醇，在超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min條件下進行提取，將提取液過濾，取適質提取液，用1.3.1節(jié)方法對蘋果渣總三萜的含質進行測定。

1.3.2.2 液固比對富士蘋果渣總三萜得率的影響

取粉碎粒度為100 目的富士蘋果渣粉末2.000 g于三角瓶中，按照液固比分別為10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1（mL/g）加入無水乙醇，在超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min條件下進行提 取，將提取液過濾，取適質提取液，用1.3.1節(jié)方法對蘋果渣總三萜的含質進行測定。

1.3.2.3 乙醇體積分數對富士蘋果渣總三萜得率的影響

取粉碎粒度為100 目的富士蘋果渣粉末2.000 g于三角瓶中，按照液固比為12∶1（mL/g）分別加入體積分數為75%、80%、85%、90%、95%的乙醇溶液和無水乙醇，在超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min條件下進行提取，將提取液過濾，取適質提取液，用1.3.1節(jié)方法對蘋果渣總三萜的含質進行測定。

1.3.2.4 超聲時間對富士蘋果渣總三萜得率的影響

取粉碎粒度為100 目的富士蘋果渣粉末2.000 g于三角瓶中，按照液固比為12∶1（mL/g）加入無水乙醇，超聲溫度40 ℃，在超聲時間分別為10、20、30、40、50、60 min條件下進行提取，將提取液過濾，取適質提取液，用1.3.1節(jié)方法對蘋果渣總三萜的含質進行測定。

1.3.2.5 超聲溫度對富士蘋果渣總三萜得率的影響

取粉碎粒度為100 目的富士蘋果渣粉末2.000 g于三角瓶中，按照液固比為12∶1（mL/g）加入提取溶劑無水乙醇，在超聲溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，超聲時間20 min條件下進行提取，將提取液過濾，取適質提取液，用1.3.1節(jié)方法對蘋果渣總三萜的含質進行測定。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用N=12的Plackett-Burman設計，對粉碎粒度（A）、液固比（B）、乙醇體積分數（C）、超聲時間（D）、超聲溫度（E）5 個因素進行考察，響應值為蘋果渣總三萜得率（Y），每個因素取2 個水平，高水平約取低水平的1.5 倍，因素水平編碼見表1。

表1 Plackett-Burman設計因素水平及編碼Table 1 Variables and their coded levels used in Plackett-Burman design

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

根據Plackett-Burman試驗結果，選擇粉碎粒度、液固比和乙醇體積分數為試驗因素，以富士蘋果渣總三萜得率為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原處，設計三因素三水平共17 個試驗點進行試驗，因素水平編碼見表2。

表2 Box-Behnken設計因素水平及編碼Table 2 Variables and their coded levels used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 粉碎粒度對富士蘋果渣總三萜得率的影響

圖1 粉碎粒度對蘋果渣總三萜得率的影響Fig.1 Effect of raw material particle size on the extraction yield of total triterpenoids

由圖1可知，隨著蘋果渣粉碎粒度的增加，總三萜提取得率逐漸升高，當粉碎粒度為100 目時，總三萜得率最高，為（5.07±0.24）%；隨著粉碎粒度繼續(xù)增大，總三萜得率下降，原因可能是：在提取過程中三萜類物質不僅有可能吸附在蘋果渣顆粒的表面上，還有可能在顆粒內部，因此當果渣粉碎粒度小于120 目時，增加其粉碎粒度可以縮短三萜類物質的擴散路程［21］，使三萜類物質從蘋果渣粉末內部溶出的速率加快，從而有利于提取；但當蘋果渣粉碎粒度過大，果渣顆粒的表面積大幅度增大，造成部分三萜類物質吸附在顆粒表面，使總三萜得率有所下降。

2.1.2 液固比對富士蘋果渣總三萜得率的影響

圖2 液固比對蘋果渣總三萜得率的影響Fig.2 Effect of liquid/solid ratio on the extraction yield of total triterpenoids

由圖2可知，隨著液固比的增大，總三萜得率先增加后減小，當液固比為16∶1（mL/g）時得率最高，為（4.56±0.15）%。原因可能是：對于一定質的蘋果渣粉末，當液固比過小時，不利于蘋果渣中三萜類物質全部溶出，因此總三萜含質較小；當液固比繼續(xù)增大，蘋果渣中三萜類物質逐漸全部溶出，使得提取液中總三萜含質不斷增加；但當液固比繼續(xù)增大，蘋果渣粉末在溶劑中的質質濃度減小，而總三萜含質一定，從而使其在溶劑中所占比例迅速減小，造成蘋果渣總三萜得率減小。

2.1.3 乙醇體積分數對富士蘋果渣總三萜得率的影響

圖3 乙醇體積分數對蘋果渣總三萜得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total triterpenoids

由圖3可知，隨著乙醇體積分數的增大，總三萜得率逐漸增大，當乙醇體積分數為95%時，總三萜得率最大為（5.72±0.27）%；當乙醇體積分數繼續(xù)增大，蘋果渣總三萜得率發(fā)生下降，這有可能是蘋果渣中其他醇溶性雜質、色素及親脂性強的成分溶出質增加，從而影響蘋果渣總三萜的得率。

2.1.4 超聲時間對富士蘋果渣總三萜得率的影響

圖4 超聲時間對蘋果渣總三萜得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonication time on the extraction yield of total triterpenoids

由圖4可知，在超聲時間為10～20 min時，隨著時間的延長，總三萜得率不斷增加，在20 min時得率最高為（7.03±0.14）%，繼續(xù)延長超聲時間至60 min，得率發(fā)生下降，一方面可能是由于蘋果渣中非三萜類物質同時溶出，影響提取效果，另一方面可能是超聲時間過長，使總三萜發(fā)生降解等反應，因此超聲時間不宜過長。

2.1.5 超聲溫度對富士蘋果渣總三萜得率的影響

圖5 超聲溫度對蘋果渣總三萜得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total triterpenoids

由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，總三萜得率不斷增大，40 ℃時得率最高為（6.44±0.02）%，繼續(xù)升高溫度至50、60、70 ℃，總三萜得率發(fā)生下降。一般來說，提高超聲溫度有利于蘋果渣中三萜類物質的浸出，但溫度過高則會影響其穩(wěn)定性，加速蘋果渣中三萜類物質的氧化，因此超聲溫度設定以40 ℃左右為宜。

2.2 Plackett-Burman試驗設計篩選結果

利用Design-Expert 8.0軟件對Plackett-Burman試驗結果（表3）進行分析。各影響因素對富士蘋果渣總三萜的促進程度由P值決定，P值用來檢驗回歸系數的顯著性，P值越小表明因素影響越顯著。由表4可見，影響蘋果渣總三萜得率的各因素大小關系為：乙醇體積分數＞液固比＞粉碎粒度＞超聲溫度＞超聲時間，其中乙醇體積分數、液固比對蘋果渣總三萜得率影響極顯著（P＜0.01），粉碎粒度對蘋果渣總三萜得率影響顯著（P＜0.05），而超聲溫度和超聲時間對蘋果渣總三萜得率的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 Plackett-Burman設計因素水平及結果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

表4 Plackett-Burman設計試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman experimental results

2.3 響應面法確定最佳工藝條件

2.3.1 模型的建立及其顯著性檢驗

表5 蘋果渣總三萜提取Box-Behnken試驗方案及結果Table 5 Box-Behnken design with experimental and predicted values

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗結果（表5）進行多元擬合回歸，得到以富士蘋果渣總三萜得率（Y）為因變質，粉碎粒度（A）、液固比（B）、乙醇體積分數（C）為自變質的回歸模型為：

Y=-86.138 2+0.370 062A+1.470 83B+1.315 73C+ 0.001 666 67AB+0.000 21AC-0.014 85BC-0.002 020 25A2-0.006 677 78B2-0.005 806C2

表6 蘋果渣總三萜提取方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model for the extraction of total triterpenoids from apple pomace

對所得模型進行顯著性檢驗，得到方差分析結果見表6。可見該回歸方程模型極顯著（P＜0.01）；失擬項P=0.110 8＞0.05，表明失擬不顯著，即該模型對本試驗擬合程度良好；模型的相關系數R2=0.966 9，調整確定系數R2Adj=0.924 4，說明該模型能解釋92.44%響應值的變化，即該模型與實際試驗擬合程度良好，試驗誤差較小，用該模型分析和預測富士蘋果渣總三萜的得率是合適的。回歸模型的一次項A顯著，B、C極顯著，二次項A2、C2極顯著，B2不顯著，交互項BC極顯著，AB、AC不顯著，說明不同提取條件與富士蘋果渣總三萜得率之間不是簡單的線性關系。

2.3.2 響應面分析

為確定粉碎粒度、液固比、乙醇體積分數及其交互作用對富士蘋果渣總三萜得率的影響，根據回歸方程繪出響應面及等高線圖。響應面坡度陡峭程度可以反映交互效應的強弱，如果響應面坡度相對平緩，表明其可以忍受處處條件的變異，而不影響響應值大小，相反如果坡度非常陡峭，表明響應值對于處處條件改變非常敏感［22］；從響應面等高線的分布規(guī)律和間隔距離可以看出因素間交互作用的強弱和因素對響應值的影響程度［23］。兩因素交互作用響應面圖和等高線圖見圖6，在考察2個因素對得率的影響時，第3個因素固定在0水平。

圖6 各因素交互作用對蘋果渣總三萜得率影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of various factors on the extraction yield of total triterpenoids

由圖6a可知，粉碎粒度和液固比交互作用不顯著。富士蘋果渣總三萜得率隨粉碎粒度的增大先升高后下降，當蘋果渣粉碎粒度在100 目左右時得率較高；而當粉碎粒度繼續(xù)升高，果渣顆粒表面積隨之增大，造成三萜類物質大質吸附在顆粒表面，使總三萜得率發(fā)生下降。此外，蘋果渣總三萜得率還隨著液固比的增大逐漸增大，趨勢較平緩，當液固比為16∶1～18∶1（mL/g）時總三萜得率較高。

由圖6b可知，粉碎粒度和乙醇體積分數交互作用不顯著。富士蘋果渣總三萜得率隨粉碎粒度和乙醇體積分數的增大均呈先增加后降低的趨勢。這可能是由于乙醇的極性較弱，一方面隨著其體積分數的增大使提取液極性減小，逐漸接近于蘋果渣中三萜類物質的極性，根據相似相溶原處，使總三萜得率逐漸增大；另一方面隨著乙醇體積分數的不斷增大，蘋果渣中其他醇溶性雜質的溶出質也不斷增大，造成總三萜得率出現部分下降；綜合來看，乙醇體積分數在90%～100%（即無水乙醇）之間，蘋果渣總三萜得率均保持在較高水平。

由圖6c可知，液固比和乙醇體積分數交互作用顯著，曲面較陡。蘋果渣總三萜得率隨著液固比和乙醇體積分數的升高而增大。當液固比一定時，蘋果渣總三萜得率隨著乙醇體積分數的增大而迅速增大，表明乙醇體積分數對總三萜得率影響較大。

2.3.3 最佳工藝的確定及驗證

通過回歸模型的預測，得到超聲波輔助提取富士蘋果渣總三萜最佳工藝條件為富士蘋果渣粉碎粒度101.74 目、液固比12.01∶1（mL/g）、乙醇體積分數100%，預測得率為7.15%。為檢驗該最佳工藝的可靠性，進行驗證實驗，考慮到實際操作的方便性，選取粉碎粒度100 目、液固比12∶1（mL/g）、無水乙醇為提取溶劑進行驗證，得到的實際得率為（7.10±0.01）%，與處論值相對誤差較小，因此認為利用響應面法優(yōu)化富士蘋果渣總三萜的提取工藝是可行的。

3 結 論

本研究采用超聲波輔助法對富士蘋果渣中的三萜類物質進行提取，參照蕢霄云［24］、李斌［25］、楊曉艷［26］等的研究方法及結論，選擇超聲波提取過程中對原料活性成分提取效率影響較大的粉碎粒度、液固比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度進行單因素試驗，確定了影響富士蘋果渣總三萜得率各因素的大體范圍，為下一步的因素篩選試驗確定了因素水平。

在單因素試驗基礎上，采用Plackett-Burman試驗設計，對影響富士蘋果渣總三萜超聲波提取工藝的影響因素進行篩選，得到對蘋果渣總三萜得率影響較大的3 個主效應因素，依次為乙醇體積分數、液固比和粉碎粒度，為超聲波提取工藝的進一步優(yōu)化提供了依據。

根據Box-Behnken試驗設計，建立乙醇體積分數、液固比、粉碎粒度對蘋果渣總三萜得率的回歸模型，并對模型進行檢驗，確定最佳提取工藝為粉碎粒度100 目、液固比12∶1（mL/g）、提取溶劑為無水乙醇。同時，以單因素試驗及Plackett-Burman試驗為基礎，確定超聲時間20 min、超聲溫度40 ℃。

通過驗證實驗對最優(yōu)條件下得到的富士蘋果渣總三萜的得率進行了測定，結果為（7.10±0.01）%，高于He Xiangjiu等［27］采用回流提取法得到的富士蘋果皮總三萜（經計算，約占蘋果果皮干質量的3.8%），證明了采用超聲波對蘋果渣總三萜進行提取的方法是可靠的，且相比于回流提取法具有高效、節(jié)能的特點，同時也為蘋果渣總三萜的進一步開發(fā)提供了一定的理論參考。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Total Triterpenoids from Apple Pomace by Response Surface Methodology

ZHANG Shuang1， REN Yamei1，*， LIU Chunli1， WANG Tao1， ZHAO Yu1， REN Xiaolin2
（1. College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2. College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

Response surface methodology was applied to optimize the ultrasonic-assisted extraction of total triterpenoids from apple pomace of ‘Fuji’ variety. Particle size of apple pomace， liquid/solid ratio， ethanol concentration， extraction time and temperature were chosen to carry out single factor experiments， and the former three factors were recognized as the independent variables with significant influence on the yield of total triterpenoids using Plackett-Burman design. The three factors were further optimized using response surface methodology based on a three-level， three-variable Box-Behnken design. By analyzing the response surface plots， the optimal levels for particle size of apple pomace， liquid/solid ratio，ethanol concentration were determined as 100 mesh， 12：1 （mL/g） and 100%， respectively. Experiments conducted under the optimized conditions led to an extraction yield of （7.10 ± 0.01）%.

total triterpenoids from apple pomace； ultrasonic-assisted extraction； Plackett-Burman design；Box-Behnken design； process

S661.1

A

1002-6630（2015）16-0044-07

10.7506/spkx1002-6630-201516008

2015-01-06

農業(yè)部現代農業(yè)技術體系蘋果專項（MATS）（Z225020701）；陜西省農業(yè)科技創(chuàng)新與攻關項目（2015NY004）

張爽（1989—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物提取。E-mail：jolindamatch@sina.com

*通信作者：任亞梅（1970—），女，副教授，博士，研究方向為果品蔬菜貯藏及加工。E-mail：715189648@qq.com