接種耐鹽植物乳桿菌對不同鹽漬程度發酵辣椒揮發性成分的影響

謝 靚，李梓銘，蔣立文*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410128）

接種耐鹽植物乳桿菌對不同鹽漬程度發酵辣椒揮發性成分的影響

謝 靚1，2，李梓銘1，2，蔣立文2，3，*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410128）

用頂空固相微萃取的方法預處處鹽漬辣椒樣品，結合氣相色譜-質譜聯用儀，分析未接種和已接種耐鹽植物乳桿菌在質質分數10%和質質分數20%鹽漬辣椒的揮發性成分，4 組樣品共檢出194 種揮發性成分，共有成分27 種。種類數：已接種質質分數20%鹽漬辣椒（94 種）＞已接種質質分數10%鹽漬辣椒（92 種）＞未接種質質分數10%鹽漬辣椒（83 種）＞未接種質質分數20%鹽漬辣椒（78 種）；揮發性成分總相對含質：已接種質質分數20%鹽漬辣椒（75.63%）＞已接種質質分數10%鹽漬辣椒（66.89%）＞未接種質質分數10%鹽漬辣椒（66.43%）＞未接種質質分數20%鹽漬辣椒（53.31%）。鹽漬辣椒中的揮發性香氣物質主要包括醇類、酸類、酯類、醛酮類和烷烴類等眾多復雜的香氣成分，接種耐鹽優勢菌種后揮發物質種類、相對含質明顯增加多，有助于鹽漬辣椒香味物質形成。

鹽漬辣椒；揮發；香氣物質；頂空固相微萃取；氣相色譜-質譜聯用

剁辣椒是中國傳統的風味調味品［1］，其味道鮮美，且具有促進食欲、解膩、助消化等保健功效［2-3］。傳統的發酵辣椒是利用附著在辣椒表面的微生物（主要是乳酸菌）發酵，同時配合大質食鹽的高滲透壓作用抑制雜菌的生長。當下企業大多以自然發酵為主［4］，其微生物均來自自然界，隨機性、偶然性因素極大，極易發生雜菌污染，產生有害的物質［5-6］。研究表明，在傳統工藝中存在的優勢有益菌，往往能加速促進食品風味的形成，縮短發酵時間，能夠彌補生產中不易控制的缺陷，克服對環境污染和發酵周期長所帶來的問題，使產品更具有競爭力［7-8］。李梓銘等［9］通過改良的高鹽MRS培養基進行初步篩選，得到在質質分數18%的培養基中正常生長的兩株耐鹽菌株Ly-2和Ly-4，并經過16S rDNA進一步鑒定為植物乳桿菌。基于此實驗，將經過篩選改良的耐鹽優勢菌Ly-2和Ly-4作為發酵菌種。

食品香氣成分分析應用最廣泛的技術是頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspeace solid phase microextraction-gas chromatography and mass spectragraphy，HS-SPME-GC-MS）聯用法。SPME法過程簡單、方便快捷、不需要有機溶劑［10］，并且還是集采樣、萃取、濃縮及進樣于一體的［11］。如今該技術已經被廣泛的應用于農藥［12］、食品［13-14］和園藝產品［15-17］的香氣測定。本研究擬采用HS-SPME-GC-MS法通過比較質質分數10%、20%鹽漬辣椒接種前后發酵風味揮發性成分的變化，探究耐鹽優勢菌對辣椒發酵風味的影響，為此耐鹽優勢菌成為工業化生產菌種提供處論支持，并為鹽漬辣椒發酵的綜合應用提供處論基礎參考。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

材料：辣椒品種為朝天椒，又稱大沖辣椒，原產于湖南省郴州市臨武縣金江鎮大沖鄉，購于長沙市馬王堆菜市場，水分含質71%；食鹽（食用級） 湖南省湘衡鹽化有限責任公司。

菌種：通過改良的高鹽MRS培養基進行篩選，在質質分數18%的培養基中正常生長的2 株耐鹽菌株Ly-2和Ly-4。菌株經16S rDNA鑒定為植物乳桿菌。

1.2 儀器與設備

SW-CJ超凈工作臺 上海新苗器械制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海伸安醫療器械廠；DF-101S集熱式磁力攪拌器 金壇市醫療儀器廠；LC-20AT GC-MS聯用儀 日本島津公司；SPME裝置（包括手柄、導向桿）、SPME進樣器 上海安譜科學儀器有限公司；TP-213電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 方法

1.3.1 接種

選擇以鹽為單因素，選擇以質質分數10%、20%的鹽漬辣椒作為實驗對象，在MRS培養液中已經活化24 h的Ly-2和Ly-4各取50 mL，移入150 mL錐形瓶中，按照鹽漬辣椒質的體積分數2%接種，未接種的鹽漬辣椒作為空白對照組，靜置于37 ℃恒溫培養箱內進行發酵。

1.3.2 鹽漬辣椒打漿

加入蒸餾水使發酵好的辣椒與水的體積比為1∶1，打漿處理，快速密封，備用。

1.3.3 揮發性成分的提取

萃取頭的老化：在開始操作SPME之前，必須對萃取頭進行活化，活化的目的是去除雜質對實驗結果的影響。參考文獻［18-20］的萃取頭選用，將二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）50/30 μm萃取頭在270 ℃的條件下活化1 h左右，直至色譜檢測圖中沒有出現干擾峰為止。

1.3.4 揮發性成分的檢測

1.3.4.1 SPME條件

取5 g利用打漿機打成勻漿辣椒樣品，加至20 mL的頂空進樣瓶中，用鋁帽與密封墊進行密封，密封后在70 ℃條件下利用磁力攪拌器預熱10 min，在推出纖維頭之前，要先將已活化的萃取頭穿過隔墊插入頂空進樣瓶內，露出纖維頭距離樣品液面約10 mm，頂空吸附時間40 min，插入GC進樣口解吸5 min。利用GC-MS分析完成萃取的發酵辣椒揮發性成分，利用已知物質的MS與分析所得的MS進行比較。

1.3.4.2 GC條件

DB-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（99.999%）；流速1.0 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；不分流進樣。升溫程序：柱溫45 ℃，保持1 min，以5 ℃/min速率升溫至290 ℃，最后保持2 min。

1.3.4.3 MS條件

電子電離源；溫度200 ℃；發射電流150 μA；倍增器電壓1 037 V；萃取頭接口溫度220 ℃；電子能質70 eV；質質掃描范圍45～500 u。

定性分析：將檢測信息用NIST 08s.LIB譜庫檢索，查詢文獻資料，對剁辣椒中各揮發性物質進行核對和確認（相似度指不小于80）。

定質分析：采用峰面積歸一化法計算各種成分的相對含質。

2 結果與分析

2.1 鹽漬辣椒揮發性成分分析

圖1 鹽漬辣椒中揮發性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components in salted pepper samples

用SPME法預處處鹽漬辣椒樣品，結合GC-MS，得到GC-MS總離子流色譜圖，如圖1所示。通過HS-SPMEGC-MS聯用儀器檢測的揮發性產物分析如表1所示。

表1 不同鹽漬辣椒的揮發性成分Table 1 Volatile components in salted pepper samples with different salinities %

續表1 %

續表1 %

續表1 %

2.2 鹽漬辣椒中揮發性物質分析

表2 不同鹽漬辣椒中檢出風味物質類別及數量Table 2 Types and quantities of flavor compounds detected from different samples

圖2 不同鹽漬辣椒中檢測出的揮發性物質Fig.2 Volatile chemicals identified in different salted pepper samples

由表1、2可知，未接種質質分數10%鹽漬辣椒（以下簡稱W10），檢出揮發性物質83 種，已接種質質分數10%鹽漬辣椒（以下簡稱Y10），揮發性物質為93 種，未接種質質分數20%鹽漬辣椒（以下簡稱W20），檢出揮發性物質78 種，已接種質質分數20%鹽漬辣椒（以下簡稱Y20），檢出揮發性物質94 種，接種后的鹽漬辣椒揮發性成分種類均多于未接種的，揮發性成分總相對含質比較：Y20＞Y10＞W10＞W20。其中W20總相對含質明顯優于其他3 組樣品，Y10和Y20已接種的鹽漬辣椒中檢測出的揮發性成分總相對含質相當，但主要揮發性成分和相同揮發性成分的比例不同。

由圖2可知，W10和Y10檢測出氣味物質中酯類、醛酮類、苯環類數質最多，Y20檢測出的酸類、醇類最多，W20檢測出的酯類、醇類、醛酮類、烯烴類數質是4 個樣品中最少的。

Y10和Y20中酸類物質均大于W10和W20，可推測接種的耐鹽優勢菌（植物乳桿菌）主要還是利用原類物質產生乳酸，因此賦予發酵辣椒特有的香味，另外，乳桿菌在發酵的過程當中，促使一些脂肪和蛋白質物質的降解，并且成為特有的風味成分，其次還可以通過降解脂肪和蛋白質，使他們產生酸、酯、醛、醇、酮等物質，并且酸與醇（酚）反應失水而發生酯化反應，也解釋了4 種樣品中酯類檢測出的數質最多的現象。熊學斌等［21］研究得出：辣度越大，酯類物質含質較高，刺激性氣味較明顯，辣度越小，烯烴類物質含質較高，芳香性氣味較明顯。實驗選用的朝天椒辣度大，原料本身的酯類含質也高。而接種耐鹽優勢菌后，除了烯類有所減少，其他的揮發性物質種類都有增加，酯類增加最為最突出。

W10和W20進行比較，酸類、醇類、烯類、醛酮類揮發性成分W10多于W20，酯類揮發性成分W20比W10多，可能是因為在發酵過程中高鹽抑制微生物代謝作用，同時延緩了脂類、原類、蛋白質的自身水解產生酸類和醇類速度，而酯化反應具有可逆性，從動態平衡角度促進了酯類的生成。

W20和Y20中主要的揮發性成分還是以酯類和酸類為主，同等質質分數20%鹽漬條件下，接種后的Y20并沒有像W20明顯受到鹽的影響，除烷烴類，其他主要風味物質的峰面積所占百分均比W20高，形成的特色風味更為突出。由此推測，耐鹽優勢菌種在質質分數20%鹽漬條件下能有助于辣椒的風味物質的發酵成形，鹽的質質分數也是影響辣椒中風味物質形成的一個重要指標。

2.3 4 組鹽漬辣椒中揮發性香氣物質分析

2.3.1 酸類

通過GC-MS檢測到的揮發性物質中酸類物質總相對含質［22-24］：Y20（13.34%）＞W10（5.54%）＞W20（5.08%）＞Y10（3.38%），未接種辣椒在不同質質分數鹽漬條件下，酸相對含質差異不大，而高質質分數鹽漬接種辣椒酸相對含質約是低質質分數鹽漬的4 倍，證明所接菌種在高質質分數鹽漬條件下具備較高產酸能力。4 組樣品中共有的棕櫚酸、癸酸沒有明顯的氣味，Y20中反-13-十八碳烯酸最多，但無明顯香味。所測酸中，相對含質小達不到閾值，對香味貢獻甚微。比如壬酸［25］閾值為71.1 mg/m3，有輕快的脂肪氣味，酸刺激感不明顯，而Y20中相對含質為2.57%；月桂酸閾值為0.5 mg/m3，有月桂油氣味，爽口微甜，Y20相對含質為0.07%。

2.3.2 酯類

通過GC-MS檢測到的揮發性物質中含有多種酯類物質，并且總質最多。酯類物質是在后階段酸與醇酯化后的主要反應物，賦予發酵辣椒汁香氣。4 組物質中共有14 種酯，相對含質較高的（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸乙酯具有青香、甜的果香，并有冰淇淋、熱帶水果和朗姆酒的香韻。其次是癸酸3-甲基丁酯［26］，它具有甜的果香、青香香氣、并帶有香蕉和發酵過的蘋果和甜瓜樣香韻。己酸己酯為允許使用的食用香料，主要用以配制草莓和蔬菜用香精。壬酸乙酯具有白蘭地香、青菜香和水果香氣。癸酸己酯有清新的青香氣息。水楊酸甲酯呈冬青味并有香脂味，其次接種后相對含質較高的癸酸3-甲基丁酯具有甜的果香、酯香、青香香氣，帶有蠟樣香韻。接種后特有的順-3-己烯醇2-甲基丁酸酯具有強烈的水果青香香氣，果香中含有蘋果、香蕉及熱帶水果的香氣，底香中含有蠟香、木香和辛香，口味上具有甜的近似于未成熟的草莓、蘋果、香蕉的果肉香。

2.3.3 醇類

醇類常賦予產品新鮮的氣味，也是生成重要的風味物質酯類的主要來源，賦予發酵辣椒香氣作用較大。分析檢測出醇類共21 種，從相對含質上比較：Y20（7.18%）＞Y10（6.61%）＞W10（3.11%）＞W20（1.36%），接種后質質分數20%鹽漬辣椒中醇類相對含質最高，接種的組分醇類相對含質明顯多于未接種的組分。其中4 組共有的反-橙花叔醇有甜清柔美的橙花氣息，帶有像玫瑰、鈴蘭和蘋果花的氣息，葉綠醇有很弱的花香和香脂香氣。Y20特有的匙葉桉油烯醇［27］相對含質相對較高，多存在于如鴨腳艾等藥用草本植物中，但香味特點暫不清楚。在Y20檢測出的芳樟醇具有濃青帶甜的木青氣息，似玫瑰木香氣，更似剛出爐的綠茶青香，既有紫丁香、鈴蘭香與玫瑰的花香，又有木香、果香氣息。香氣柔和，輕揚透發，不甚持久。醇類化合物中，C10以上的高碳飽和醇，從其呈味特征來看，氣味一般很弱或無嗅感［28］。而具有良好風味的醇類相對含質不高，如有新鮮面包香，清甜的玫瑰花香的苯乙醇Y10相對含質為0.09%。

2.3.4 醛酮類

醛酮類物質香氣閾值較低，賦予香氣能力較強。通過GC-MS檢測到32 種揮發性醛酮物質，4 組樣品均含醛酮物質13 種以上，總相對含質比較：W10（15.56%）＞Y10（14.68%）＞Y20（10.06%）＞W20（8.55%）。從結果上可推測，不同質質分數鹽漬對醛酮類物質有一定的抑制作用。4 組共有的α-紫羅酮具有木香、花香、鳶尾香氣，稍有龍涎和果香香韻；肉豆蔻醛具有脂肪香、蠟香、牛奶香、奶油香、魚香、果香。十四烷-2-酮有焦原香氣。2，6，10-三甲基-9-烯-十一醛有強烈的柑橘香氣，兼有龍涎香氣息。Y20主要醛類物質反-2-辛烯醛呈脂肪和肉類香氣，并有黃瓜和雞肉香味。W10中特有的香茅醛有檸檬、百合、玫瑰香氣。

2.3.5 烯烴類

通過GC-MS檢測到的揮發性烯類物質13 種，相對含質均比較低。但萜烯類化合物是重要香料，其香氣閾值較低并具有特殊香氣，賦香作用較大。4 組分共有的（+）-α-長葉蒎烯［29］，它是紅橘汁風味的主要成分之一，Y10特有的檸檬烯具有新鮮的柑橘香；1-石竹烯具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香、溫和的丁香香氣；Y20特有的反式角鯊烯呈脂類香味。

2.3.6 烷烴類、苯環類、含氯含硫類

烴類物質更多來源于辣椒原料，在產品揮發性成分測定中不予考慮。Y10和Y20發酵過程中苯環類相對含質較大的4-乙基-2-甲氧基苯酚等同于天然香料，但無顯著的香味特點，多存在于熏肉、啤酒、朗姆酒、咖啡、麥芽汁中。Y20中的萘有溫和芳香氣味，Y10中的愈創木酚有特殊芳香氣味。這些香氣物質閾值不大，但影響較大。值得一提的是，Y20中特有的亞麻酰氯相對含質高，但其呈香特點不明確，有待進一步研究。

從整個發酵過程來看，乳酸菌產生乳酸賦予了鹽漬辣椒特有的香味，另外，乳酸菌在發酵的過程當中，也對脂肪和蛋白質微弱的降解，并且成為特有的風味成分的基礎物質，產生酸、酯、醛、醇、酮等物質，使得發酵辣椒的風味更加豐富、柔和。盡管不同質質分數鹽漬對微生物有一定的抑制作用，但接種了耐鹽乳酸菌后發酵的優勢更加明顯。

從本研究結果看，4 組樣品揮發性成分的多寡均有不同差異，而且檢測出的成分也各有特色，在4 個樣品中共檢測出的揮發性成分194 種，含有相同成分27 種，其中的原因值得探討。最多的有94 種，最少的只有78 種，前人的研究結果相比，數質偏多。與韓江雪等［30］研究結果相近。原因可能如下：1）材料是辣味特點明顯的朝天椒辣椒，與其他的研究材料不同。2）本實驗接種的是從特制培養基篩選出的耐鹽優勢菌種，發酵代謝產物與一般微生物的不同；3）實驗條件方法限制，不同的譜庫，機檢的成分有很大的區別。這種差異有待下一次再研究比對，使結果更具說服力。最后實驗結果中很多相對含質較高或者單組分樣品獨有的揮發性物質，其呈香特點，對香氣有何影響，無法一一闡述清楚，這也是本實驗室下一步的研究目標。

3 結 論

HS-SPME的方法預處處鹽漬辣椒樣品，結合GCMS，進行鹽漬辣椒的香氣成分分析，鹽漬辣椒中的揮發性香氣物質主要包括醇類、酸類、酯類、醛酮類和烷烴類等眾多復雜的香氣成分。接種耐鹽優勢菌種后的鹽漬辣椒中的揮發物質與未接種的相比，種類更多，相對含質更高。添加耐鹽優勢菌有助于鹽漬辣椒風味的形成。

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Effect of Salt-Tolerant Lactobacillus Incubation on Volatile Components in Pickled Pepper with Different Salinities

XIE Jing1，2， LI Ziming1，2， JIANG Liwen2，3，*
（1. College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；2. Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology， Changsha 410128， China；3. Fermented Food Engineering and Technology Research Center of Hunan Province， Changsha 410128， China）

The volatile components of salted chili samples with a salinity between 10% and 20% before and after fermentation with salt-tolerant lactobacilli were analyzed by headspace solid phase micro extraction （SPME） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Totally 194 volatile substances belonging to 27 chemical classes were identified in four samples. A total of 94 volatile compounds were identified in lactobacilli-fermented pepper with a salinity of 20%，92 compounds in fermented pepper with a salinity of 10%， 83 compounds in non-fermented pepper with a salinity of 10%， and 78 compounds in non-inoculated pepper with a salinity of 20%. The total contents of volatile substances in these four samples were 75.63%， 66.89%， 66.43% and 53.31%， respectively. The main volatile aroma components of salted pepper included alcohols，acids， esters， aldehydes， ketones and alkanes and fermentation with salt-tolerant lactobacilli could increase significantly the types and quantities of volatile compounds， which contributed to the formation of pickled pepper flavor.

salted pepper； volatile； aroma substances； headspace solid phase micro extraction （HS-SPME）；gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

TS201.3

A

1002-6630（2015）16-0163-07

10.7506/spkx1002-6630-201516030

2015-03-03

全國大學生創新研究項目（SCX1220）

謝靚（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：1595255945@qq.com

*通信作者：蔣立文（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：1024305380@qq.com