一株聚β-羥基丁酸PHB高產菌株的分離與鑒定

孫新新，鄭家珍，王艷青，蔡世玉，陳雷剛(河北大學生命科學院，河北保定071200)

多聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一類廣泛存在于微生物細胞內的高分子生物聚酯，一般主要作為碳源和能量的貯藏物質［1］。目前，已發現PHAs至少有150種不同的單體結構。PHA的單體結構也多種多樣，其中3-羥基脂肪酸單體包括3-羥基丙酸到3-羥基十六酸的所有成員，還有4-、5-、6-羥基脂肪酸以及含有不飽和鍵、帶有甲基側鏈或其他功能基團的3-羥基脂肪酸作為PHA單體的情況［2］。PHAs生產的關鍵仍然是獲得高產、高轉化率的微生物菌株［3］，所以從環境中篩選出高產野生菌株是研究工作的熱點。目前研究最廣泛的是真養產堿桿菌(Alcaligenes eutropbus)。

聚3-羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是結構最簡單的PHA成員。1925年Lemoigne［4］首先發現了聚β-羥基丁酸(PHB)。它具有機械性能非常類似于傳統的塑料如聚丙烯或聚乙烯，可擠出，模制，紡成纖維，制成薄膜，并與其他合成的聚合物組成雜聚物［5］。它既可以替代石化塑料制作生產與生活用品，又可以作為醫用材料(如心臟瓣膜、人造血管、縫合線、藥物緩釋與軟組織修復)［6］，還是醫學組織工程中克隆器官的優良支架材料。筆者以苜蓿含羞草根瘤菌以及根際土壤菌為研究材料，通過革蘭氏染色、蘇丹黑染色，篩選得到一株菌為227。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 菌種來源。海南、廣東、廣西、福建自含羞草分離的根瘤菌株，云南祿豐南苜蓿根瘤菌及獲得的根瘤內生菌。

1.1.2 培養基與試劑。YMA培養基組成為:KH2PO40.25 g，K2HPO40.25 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，甘露醇10 g，酵母粉0.8 g，瓊脂15 ～18 g，pH 6.5 ～7.0。種子培養基組成為:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0 ～7.2。發酵培養基組成為:葡萄糖30 g，(NH4)2SO43 g，KH2PO4·12H2O 0.61 g，CaCl20.1 g，K2HPO40.3 g，酵母粉 1 g，HBO35 g/L，Na2MoO45 g/L 4 ml，pH 7.0［7］。PHB 標準品由中國農業大學提供。稱取3 g蘇丹黑B顆粒(西德serva進口分裝)，溶到100 ml濃度70%的乙醇中［8］，得蘇丹黑B染液。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株。將保存的甘油管菌株活化到YMA固體培養基，平板倒置28℃培養1～2 d。

1.2.2 初篩。將菌株活化后重新編號1～2 000，轉接到YMA固體培養基的培養皿中，于28℃培養24～48 h后進行革蘭氏染色。

1.2.3 復篩。采用蘇丹黑染色法將少許細菌熱固定于載玻片上后，用3 g/L蘇丹黑乙醇溶液染色10～15 min，二甲苯浸泡脫色，再用5 g/L番紅水溶液復染，置油鏡下觀察，PHB顆粒呈藍黑色，菌體呈紅色［8］。

1.2.4 PHA的提取。從試管中取一環菌接種到10 ml發酵管中，培養20 h。發酵培養基的裝液量為76 ml，取培養好的種子培養液4 ml，接種量為5%，培養40 h。將發酵液以8 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌、離心，然后冰凍備用。將離心獲得的濕菌體懸浮于45 ml蒸餾水中，加入濃度10%NaClO溶液5 ml、濃度10%SDS 5 ml，使其總體積為50 ml，在35 ℃的恒溫水浴中攪拌處理10 min。將處理后的菌液8 000 r/min離心10 min，所獲得的沉淀用蒸餾水和丙酮各洗滌1次，烘干，按照10 ml氯仿/0.2 g干菌體的比例加入氯仿，抽提，過濾，濾液蒸發，除去氯仿，以析出PHB。將析出的PHB再分別用丙酮和乙醇洗滌1次，在60～70℃的條件下烘干，得到白色粉末或薄膜狀PHB［9］。

1.2.5 篩選菌株的確定。

1.2.5.1 GUTC 法提 DNA。用濃度0.9%生理鹽水收集 TY斜面上的菌，每個斜面取1 ml生理鹽水沖洗菌體，加入到EP管，12 000 r/min離心2 min，離心洗滌3次，棄上清液，加入600 μl GUTC 緩沖液振蕩、搖勻，室溫放置 15 min，12 000 r/min 2 min，棄上清液，加入60 μl硅藻土懸液振蕩，室溫放置 15 min，12 000 r/min 2 min，棄上清液，加入 500 μl GUTC緩沖液振蕩、搖勻，室溫放置15 min，12 000 r/min 2 min，棄上清液，加入600 μl洗滌緩沖液離心洗滌2次，12 000 r/min 2 min，棄上清，加入600 μl濃度75%乙醇離心洗滌1次，12 000 r/min 2 min，棄上清，在超凈工作臺干燥沉淀物(硅藻土變白)，加入50 μl TEbuffer 55 ～65 ℃保溫5 ～7 min［10］，離心收集上清液至小EP管中。

1.2.5.2 PCR 擴增。反應條件為:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火 30s，72 ℃ 延伸 90 s，72 ℃8 min，30 個循環。

2 結果與分析

2.1 初篩 初篩的結果見圖1。根據菌體中心未染色的面積的大小，篩得200株。

2.2 復篩 利用蘇丹黑B染色初篩得到的菌株的結果見圖2。菌體外圍泛紅、內部可見明顯的藍黑色顆粒的菌株可能是產生PHAs的細菌，最后篩得一株PH產生菌。

2.3 菌株227的形態特征 菌株227桿狀，兩端鈍圓，無芽孢，革蘭氏陰性菌;細胞大小(0.5 ～0.9)μm ×(1.2 ～3.0)μm;PHB顆粒胞內舍嗜蘇丹黑B顆粒，占細胞大部分空間;菌落濕潤光滑有光澤、邊緣整齊。

2.4 PHB的提取 提取后得到PHB干品，見圖3。

2.5 227菌株16s rDNA測序結果及系統發育的分析 測序結果如下:

將該序列已登陸到GeneBank，注冊號為HM582870.1。將227菌株的16S rDNA序列在NCBI進行BLAST，所獲得的同源序列為根瘤菌的16S rDNA序列，其中相似性最高的為伯克霍爾德屬的菌株。227菌株與Burkholderia caribensis，Burkholderia hospita的同源性最高，均為98%，因此確定227菌株屬于伯克霍爾德屬。

3 結論與討論

(1)研究中，采用革蘭氏染色，進行PHB產生菌的篩選。由于根瘤菌為革蘭氏陰性菌，菌體內的酯類會呈現出中心亮點，類似芽孢狀，呈不規則狀。經蘇丹黑B染色，結合顯微鏡檢，選出PHB顆粒較大、生長較旺盛的菌株。該方法大大減少了篩選過程中的工作量，而且取得較好的效果。通過革蘭氏染色、蘇丹黑染色篩選得到的菌體更加準確。

(2)經初篩、復篩獲一高產PHB菌株227，胞內積累大量的PHB顆粒，而且發酵周期短，為今后發酵條件的進一步研究提供保證。

(3)在經過生物學特征研究后，發現菌株227為伯克霍爾德屬(Burkholderia)。它是根瘤菌中初次發現的產PHB的菌株。因此，該研究為PHB的產業化提供了菌株資源，具有很好的應用價值。

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