兩種絮凝劑對鼠李糖乳桿菌絮凝作用的研究

謝為天，劉穎，徐春厚(廣東海洋大學，廣東湛江524088)

殼聚糖是一種天然高分子絮凝劑，無毒副作用，不會造成二次污染。殼聚糖與海藻酸鈉交聯后形成的縮聚物具有更優良的絮凝和吸附性能，常被用于污水的凈化處理，在食品發酵工業上也常用于除去發酵液中的菌體，近來也被用于生產益生菌的研究［1－7］。由于鼠李糖乳桿菌發酵液pH介于3～4，而黃豆漿中大豆蛋白的等電點約為pH 4.5，帶正電荷的大豆蛋白質膠體微粒與帶負電荷的細菌發生凝聚而沉淀析出［9－12］。筆者以殼聚糖－海藻酸鈉和黃豆漿為絮凝劑，研究鼠李糖乳桿菌發酵液的絮凝效果，為該益生菌的液體培養與菌體收集提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種 鼠李糖乳桿菌LT22，由廣東海洋大學預防獸醫學實驗室分離、鑒定和保存。

1.2 液體發酵培養基 組成為蛋白胨12 g、牛肉浸膏10 g、酵母浸膏4 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉3 g、檸檬酸氫二銨2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、MnSO4·H2O 0.1 g、吐溫-80 0.6 g、蒸餾水1 000 ml，pH 6.2 ～6.4，每瓶分裝 250 ml，115 ℃滅菌20 min。

1.3 絮凝劑的配制

1.3.1 濃度1.5%殼聚糖溶液。取殼聚糖1.5 g，加濃度1%醋酸溶解100 ml溶解，115℃滅菌20 min。

1.3.2 濃度1.0%海藻酸鈉溶液。取海藻酸鈉1.0 g，加蒸餾水100 ml，溶解，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.6，115℃滅菌20 min。

1.3.3 黃豆漿。取黃豆100 g，置于300 ml蒸餾水中浸泡，6 h后磨制成豆漿，過濾，離心，去除沉淀后補充水至300 ml，115℃滅菌20 min。

1.4 絮凝發酵菌液 將鼠李糖乳桿菌接種于液體發酵培養基，37℃培養48 h，連傳2代;第2代鼠李糖乳桿菌培養物即為絮凝發酵菌液，備用。

1.5 殼聚糖－海藻酸鈉絮凝試驗

1.5.1 試驗設計。用殼聚糖和海藻酸鈉二因子三水平數的一般全因子試驗設計(表1)，設3個重復。

1.5.2 絮凝方法。將250 ml絮凝發酵菌液置于燒杯中，在磁力攪拌下緩慢加入海藻酸鈉溶液，攪拌均勻后加入殼聚糖溶液，繼續攪拌20 min，靜置2 h。取絮凝后的發酵菌液液面下2 cm處上清液，用生理鹽水進行10倍倍比稀釋。取適當稀釋度溶液，測定吸光值(A600)，即為絮凝后上清液吸光值。

1.5.3 絮凝效果評價。用沉降率評價殼聚糖和海藻酸鈉絮凝劑對鼠李糖乳桿菌的絮凝效果。

沉降率(%)=(1－絮凝后上清液吸光值/混合絮凝發酵菌液吸光值)×100

按試驗設計將不同添加量的殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液與絮凝發酵菌液混合，攪拌均勻，立即用生理鹽水進行10倍倍比稀釋，取適當稀釋度溶液測定吸光值(A600)。

1.6 黃豆漿絮凝試驗

1.6.1 試驗設計。采用三因子數和三水平數的一般全因子設計，設3個重復。

1.6.2 絮凝方法。將250 ml絮凝發酵菌液置于三角瓶中，緩慢加入黃豆漿，搖勻，在不同溫度的恒溫箱中靜置一定時間，絮凝后上清液吸光值測定同“1.5.2”。

1.6.3 絮凝效果評價。評價方法同“1.5.3”，只是將其中的殼聚糖和海藻酸鈉絮凝劑換成黃豆漿絮凝劑。在不同添加量的黃豆漿與絮凝發酵菌液混合后，立即用酸度計測定pH。

1.7 數據處理 用Minitab15軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖－海藻酸鈉溶液對發酵菌液的絮凝效果 殼聚糖與海藻酸鈉溶液不同水平組合對鼠李糖乳桿菌絮凝效果見表1和圖1。

由表1和圖1、2可知，當殼聚糖與海藻酸鈉的添加量在6～8 ml時，菌體沉降率處于最大值的深綠色區域;當殼聚糖添加量固定為3 ml時，菌體沉降率在海藻酸鈉添加量為3 ml時有最大值(89.45%)，且隨著海藻酸鈉添加量的增加而明顯下降;當殼聚糖添加量固定為6 ml時，菌體沉降率在海藻酸鈉添加量為6 ml時有最大值(90.35%)，且隨著海藻酸鈉添加量的增加或減少均明顯下降。

2.2 黃豆漿對發酵菌液的絮凝效果 由表2和圖3、4可知，影響菌體沉降率最大的因素為絮凝時間和絮凝溫度。黃豆漿的添加量對沉降率的影響有隨添加量的增加而增大的趨勢，但效果不顯著;菌體沉降率大于80%的發酵液pH均處于3.65～3.82之間，當發酵液 pH大于3.82時，菌體沉降率均低于70%。可見，發酵液與豆漿混合時的pH對鼠李糖乳桿菌的絮凝效果有明顯的影響。

表2 黃豆漿對發酵菌液的絮凝效果

3 討論

3.1 殼聚糖－海藻酸絮凝劑 殼聚糖－海藻酸鈉具有凝聚鼠李糖乳桿菌的良好性能。在250 ml鼠李糖乳桿菌發酵液中添加濃度1.5%殼聚糖溶液和濃度1.0%海藻酸鈉溶液的體積為6～8 ml時，鼠李糖乳桿菌的絮凝沉淀率達90.35%。魯詩鋒等［13］考察了12種絮凝劑或沉淀劑對1，3-丙二醇發酵液的絮凝處理的效果，發現殼聚糖效果最佳，對發酵液中菌體的去除率達99.97%。張江紅等［14］用殼聚糖、海藻酸鈉復合絮凝劑處理2，3-丁二醇發酵液去除其中菌體，絮凝率達98%。由此可知，殼聚糖-海藻酸鈉絮凝劑具有絮凝細菌的良好效果。但是，用這種復合絮凝劑凝聚沉淀得到菌體難以分散，至于其是否影響益生菌在動物生產上的使用效果有待進一步的研究。

3.2 黃豆漿絮凝劑 黃豆漿在最適條件下對鼠李糖乳桿菌的絮凝沉淀率達87.49%，比應用殼聚糖-海藻酸鈉復合絮凝劑的菌體沉淀率稍低，但黃豆漿作為絮凝劑收集到的活菌體具有良好的分散性，對益生菌的生產較有利，而且大豆蛋白對活菌體起營養和保護作用。

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