植物根系分泌蛋白研究進展

趙 坤，呂孝敏，胡訓霞，張 萍，史春陽，王喜慶，葛才林，王澤港(揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州225009)

根系分泌物是植物與外界信息、物質、能量交流和交換的重要載體物質。早在18、19世紀，Plenk等就發現根系分泌物具有促進生長和抑制鄰近植株的作用。到20世紀50年代，研究者發現了根系分泌物與固氮菌之間的互利關系。在20世紀70～90年代，根系分泌物的研究進入一個新的時期。根系分泌物在植物營養、農業生產與環境等領域得到廣泛應用，而且根系分泌物與根際微生物間相生、相克關系就成為當時一個重要的研究方向［1］。時至今日，國內外學者在微生物學、土壤學等相關學科的不斷發展和研究技術不斷改進的基礎上，逐步了解和完善不同植物根系分泌物的種類、分泌機制、根系分泌物的檢測方法，并且在根系分泌物與根際微生態環境之間相互作用等方面的研究都取得很大的進步。目前，一般把復雜的根系分泌物分為三類:一是具有較強的黏性、吸附性和潤濕作用的大分子的有機分泌物，如多糖、多聚半乳糖醛酸及少量蛋白質、胞外酶;二是具有絡合、鰲合能力的小分子的可溶性有機物，主要有可溶性糖、氨基酸、有機酸、酚類等，它們可以為根際微生物提供重要的碳源;三是其他有機分泌物，主要是維生素、生長素、膽堿、煙酸［2-4］。最初對根系分泌物的研究主要局限在小分子物質一類，具有代表性的是張福鎖等對麥根酸植物鐵載體的研究。另外，研究發現，植物在高濃度的金屬脅迫下能夠形成植物螯合肽(Phytochelatins，PCs)。PCs既可以在根際環境存在，又可以在植物體內存在。PCs主要起到對過量金屬的解毒和維持微量金屬元素體內平衡的作用。然而，PCs是否由相關的基因控制還有待于進一步的研究［5］。根系分泌蛋白作為根系分泌物的重要成分近年來逐漸成為研究熱點。分泌蛋白參與植物相關的根系胞外信號途徑、形態發生、細胞凋亡、細胞分化等多種生物過程，并且根系分泌蛋白還對土壤養分有化學活化作用、修飾土壤且提高植物的抗逆能力。同時，根系分泌的酶類蛋白是對土壤酶的一個補充，并且影響根系蛋白分泌的因素除與植物種類及其生理特性有關外，還與外界環境密切相關。這其中主要包括養分脅迫、根際微生物等。Doloressa等［6］根據內質網和內質網信號肽在蛋白質合成中的作用，把嗜熱細菌來源的木聚糖酶、水母的綠色熒光蛋白和人胎盤分泌的堿性磷酸酶(SEAP)3種重組蛋白定位到質外體中，通過根分泌和葉分泌途徑獲得表達，從而建立2種新的重組蛋白表達系統——植物根分泌和葉分泌，簡化分離和純化程序，為利用轉基因植物大規模生產重組蛋白提供潛在的途徑，同時表明根分泌途徑與內質網分泌途徑具有相似性。但是，根系分泌蛋白較少，而且多數分泌蛋白是酶類蛋白，富集、分離、鑒定工作繁雜、效率低;同時，植物分泌蛋白水平處于動態變化中，往往導致分泌蛋白質組學的試驗結果重復性差，目前對植物根系分泌蛋白的研究相對集中在脅迫條件下根系對逆境環境應答方面的研究［7-9］。

1 分泌蛋白的主要分泌機制

在植物生長、發育過程中，細胞之間必須進行信息傳遞以保證基本的生命活動。其中，蛋白質分泌就是細胞間進行信息傳遞的重要方式之一。

蛋白質分泌包括2條基本的途徑。一是經典分泌途徑。在這一途徑中，蛋白質N端具信號肽序列，且依賴于內質網(ER)和高爾基體(Golgi apparatus)，即ER-Golgi途徑。二是非經典的分泌途徑。分泌蛋白不含N端信號肽序列，其分泌過程不依賴于ER-Golgi。非經典分泌又包括至少4種不同的分泌方式(圖1)［10］。

1.1 經典分泌途徑 在經典分泌途徑中，ER參與初生蛋白的合成、折疊、組裝、轉運與分泌［11］。蛋白質的合成都是從細胞質中游離核糖體上開始的。經典的內質網-高爾基體蛋白質在其N端具有信號肽序列。當合成的信號肽序列被信號識別顆粒(SRP)識別結合后，肽鏈延伸終止，此后SRP與受體結合，SRP脫離信號肽，蛋白質合成重新開始，與此同時信號肽引導新肽鏈進入內質網腔，而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除，肽鏈延伸到終止。進入內質網腔的多肽鏈還要經過各種修飾加工，如糖基化(Glycosylation)、羥基化(Hydroxylation)、酰基化(Acylation)和二硫鍵(Disulfide bond)的形成等。糖基化伴隨著多肽鏈的合成同時進行，是內質網中最常見的多肽鏈加工方式。在內質網腔中加在多肽鏈上的寡糖鏈，還要在高爾基體中進行一系列復雜的加工才能成為有活性的分泌蛋白。在合成過程中，多肽鏈在內質網腔中要進行折疊。不能正確折疊的多肽鏈一般不能進入高爾基體，而在內質網腔中很快地被降解［12］。

1.2 非經典蛋白質分泌途徑 近年來研究發現，在真核細胞中存在著一類無信號肽的分泌蛋白。這些在細胞外有明確功能的蛋白質且不含有信號肽的分泌蛋白不依賴于ERGolgi途徑，而是通過其他途徑進行分泌。這類分泌途徑被稱為非經典分泌途徑［10］。它們的分泌不需要ER-Golgi的參與，因此ER-Golgi分泌途徑的抑制劑布雷菲爾德菌素A(BFA)和莫能菌素不能抑制非經典蛋白的分泌。蛋白的非經典分泌是有選擇性的，不是細胞內容物被動釋放的結果，而且不伴隨著其他諸如LDH等細胞死亡標志物的出現［13］。因此，這一類蛋白被稱為非經典分泌蛋白。

非經典蛋白質分泌途徑作為另一種廣泛存在的蛋白質分泌方式，在胞外信號途徑、形態發生、細胞凋亡、細胞分化等多種生物過程中發揮著重要作用，是“內質網-高爾基”途徑有效的補充和替代。以下是真核細胞非經典分泌蛋白的特點:①蛋白質的相對分子量為12～45 kDa，沒有有功能的信號肽，通常由胞質內游離核糖體合成;②這些蛋白質多為單體，有不參與形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，它們不需要經過ER-Golgi的翻譯后修飾;③ER-Golgi的蛋白分泌途徑的抑制劑布雷菲爾德菌素A不能抑制非經典蛋白分泌途徑［14］;④非經典分泌途徑被證明依賴于能量和溫度，并且在多種條件下被抑制或激活，是可調控的［15-16］;⑤非經典蛋白分泌過程被 NK-κB 依賴的信號傳導途徑［17］、細胞分化［18］和轉錄后修飾(如磷酸化)等所調控［19］。

盡管非經典分泌蛋白有許多共同的特征，但不同的分泌蛋白也有其各自的分泌機制，主要分為組成型和調節型分泌。目前已有4種非經典蛋白分泌途徑被廣泛報道，分別是①經多囊體(MVBs)分泌;②經液泡與細胞膜融合的分泌;③不依賴于高爾基體的胞質蛋白分泌，如甘露醇脫氫酶(MTD)和潮霉素磷酸轉移酶(HYG?);④經雙層膜細胞器EXPO 的分泌［10］。

1.2.1 MVBs介導的蛋白分泌途徑。MVBs介導的蛋白分泌在動物中研究報道較多。近年來，越來越多的研究表明植物中同樣存在MVBs介導的蛋白分泌過程［20］。MVBs在植物細胞中也被稱作液泡前體(Prevacuolar compartments，PVCs)或晚期胞內體(Late endosomes，LEs)。在植物受真菌等病原體感染時，往往會誘導植物體啟動MVBs介導的蛋白分泌。這種由MVBs分子機器介導的非經典蛋白分泌在植物體內獨具特色。病程相關的貨物蛋白通過該途徑轉運至胞外病原感染的乳突部位［21-23］。關于MVBs的來源，既有源于質膜的轉內吞作用，又有重新生物合成的［22-24］。Scheuring等［25］以擬南芥為材料的研究表明，植物中的MVBs起源于TGN/EE。在這一形成過程中，需要內吞體分選轉運復合體(Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)的參與且形成管腔內空泡，也需要膜聯蛋白(Annexin)以完成MVBs作為運輸載體向液泡的釋放。ESCRT系統是真核細胞中完成胞內體(Endosome)膜內陷以形成多囊泡體(multi-vesicular body，MVB)的分子機器。ESCRT系統包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和 Vps4-Vta1 共 5 個蛋白 - 蛋白復合物。晶體學研究已經解析了大部分復合物的結構。它促使膜內陷的分子機理一般認為分3步:首先是ESCRT-Ⅰ和-Ⅱ在內體膜上結合，并且促使內體膜內陷形成初始芽體;然后，ESCRT-Ⅲ在芽體頸部聚合，并且導致芽體的剪切，從而將內腔囊泡(Intralumenal vesicles，ILVs)釋放到內體腔，形成MVB;最后，Vps4/Vta1復合物以水解ATP提供能量將聚合的ESCRT-Ⅲ解聚以循環利用，完成更多的出芽過程［26］。Nielsen等［27］用大麥白粉菌感染擬南芥時發現，僅有3種SNAREs(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein receptors)分泌蛋白在侵染部位積累，分別是PENETRATION1(PEN1，也就是擬南芥中的AtSYP121)、ROR2(required for mlo-sjpecified resistanse 2，是大麥中PEN1的同系物)和AtSNAP33(即擬南芥中的soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein 33)。只有特殊類型的MVBs參與病原菌侵染的應激響應過程。

MVBs除參與病原應激響應外，還參與在正常生長條件下蛋白的非經典途徑分泌。在動物細胞中，外泌體(Endosomes)是來自于MVBs和PM融合后的管腔囊泡［28］。不同研究者利用超速離心技術［29］、免疫熒光標記技術［30-31］、免疫電子顯微鏡技術［32］在不同植物的胞外空間(Extracellular space，ECS)也發現了類似的外泌體囊泡。也有研究發現，在向日葵幼苗的ECS中檢測到不受BFA影響的LSP-jacalin相關植物凝集素(Helja)。該凝集素存在于類似外泌體的囊泡中［30］。越來越多的研究表明，MVBs是植物體內介導蛋白非經典分泌的重要方式之一。

1.2.2 不依賴于高爾基體的胞質蛋白分泌。不依賴于高爾基體的胞質蛋白分泌又稱為高爾基體旁路分泌(Golgi-bypass pathway)。在動物體內，ARF-GEF抑制劑BrefildinA(BFA)是一種常被用來檢測含信號肽蛋白是否經高爾基體旁路分泌的有效工具。在20多年前，第一次用該方法在植物中檢測到多個高爾基體旁路分泌的蛋白，當時發現在煙草懸浮培養細胞液中存在多種多肽對BFA不敏感［33-34］。

迄今為止，在植物中發現的由高爾基體旁路分泌的蛋白主要有芹菜中的MTD和擬南芥中的HYGR兩個。一般情況下，MTD是植物和真菌體內參與代謝與滲透調節的重要的碳水化合物。Cheng等［35］應用透射電子顯微鏡法觀察到MTD在病原防御相關的植物激素水楊酸(SA)的誘導下會分泌至細胞外空間。該蛋白不含信號肽序列，是典型的無導肽分泌蛋白(LSP)。用高爾基體抑制劑Brefeldin A(BFA)處理，發現MTD分泌對BFA不敏感，也就是說其分泌不依賴于高爾基體。MTD通過非經典分泌途徑可實現其多樣性的細胞功能。在正常條件下MTD參與細胞內的代謝與滲透調節功能，而在病原侵染等逆境條件下MTD可通過非經典分泌途徑分泌至細胞外，并且將病原真菌分泌的甘露醇降解，以防其對活性氧的猝滅作用。這是因為活性氧對真菌的侵染有重要的抑制作用。HYGR是Zhang等［36］在擬南芥中發現的第2個存在于植物中的由高爾基體旁路分泌的無導肽分泌蛋白。它可以磷酸化和鈍化潮霉素B。利用熒光免疫檢測技術和免疫金標記技術，發現擬南芥的突觸結合蛋白SYT2(Synaptotagmin 2)定位于高爾基體，SYT2與HYGR-GFP共表達，導致轉基因擬南芥對潮霉素B的超敏反應。在細胞內和胞外空間均被檢測到，但其分泌對BFA處理不敏感，表明其分泌不依賴于高爾基體的介導，而是受定位于高爾基體的SYT2的調控，并且通過非經典途徑分泌，但對于這一分泌途徑的機制了解甚少。

1.2.3 液泡與質膜融合介導的蛋白分泌途徑。有研究表明，當受到病原細菌侵染時，擬南芥的液泡會與質膜在感染部位融合而將植物防御相關的液泡酶分泌至質膜外，以實現對生物脅迫的應激反應［37］。在該融合過程中需要蛋白酶體復合物的催化。研究表明，組成蛋白酶體的3個組分中任意一個被沉默，那么液泡與質膜的融合就會被抑制［38］，而該融合過程的抑制劑可以被蛋白酶體復合物降解，不過這種抑制劑到目前還未被分離、鑒定出來［18］。眾所周知，液泡的常規功能是維持植物細胞的完整性，即保持細胞的膨脹壓。因此，液泡與質膜融合的存在就必然給人們帶來很多疑問，比如，該融合過程中植物細胞如何實現病原防御?如何在液泡與質膜融合后保持細胞的完整性和活力?是否有新的液泡產生?

1.2.4 EXPO介導的蛋白分泌途徑。胞外復合物(Exocyst comples)最早是在酵母中被分離、鑒定的［39］。后來，在動物［40］和植物［41］中相繼被發現，包括其功能也被報道［42］。在酵母和動物細胞中，胞外復合物僅有一個拷貝，而在大多數植物細胞中則存在相當數量的旁系同源基因如EXO70s，在擬南芥中估計有23個旁系同源基因，而在水稻中可能有47個之多，但其功能尚未知［43-44］。植物中如此之多的EXO70s，表明不同的胞外復合物亞基可組合成更多的胞外復合物。這些胞外復合物除具有常規的質膜系留作用外，可能還具有其他特定的功能［45-47］。在細胞水平上，擬南芥中的AtEXO70E2亞基被用作探測鑒定新的細胞組分EXPO的有效工具［48］。由于與已知細胞器或內吞途徑標記物FM4-64缺乏同源序列，又對常規的轉運抑制劑BFA、wort-mannin或concanamycin A沒有響應，EXPO被認為不參與經典的分泌途徑或內吞途徑。但是，AtEXO70E2-GFP和EXPO-GFP在細胞外被檢測到，表明EXPO通過非經典途徑分泌。另外，LSP:SAMS2(S-adenosylmethionine synthetase 2)在瞬時表達后可共定位于EXPO。這些研究結果表明，該蛋白是被EXPO逐步扣留并最終分泌到細胞外。SAMS2(S-adenosylmethionine synthetase 2，S-腺苷甲硫氨酸合成酶2)是目前唯一研究較深入的通過EXPO途徑分泌的蛋白［48］。這是關于植物體內通過EXPO介導的非經典蛋白分泌的首次報道。

2 根系分泌蛋白的研究技術和方法

2.1 根系分泌蛋白的分離 根系分泌蛋白是混雜在根系分泌物中的。要想研究根系分泌蛋白，必須先獲得根系分泌物。目前獲得根系分泌物的方法有很多種，常用的有基質培養收集、溶液培養收集、土培收集等方法。根據不同的試驗做出改進的方法，有分根收集裝置［49］、自動連續收集系統［50］以及塑料管連接多孔陶土頭減壓原位收集［51］等。在根系分泌物收集之后，進一步作分離純化等預處理才能進行有效的定性、定量分析，而常規的蛋白質分離方法如沉淀法、吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾等方法對蛋白含量低且成分復雜的根系分泌物，很難獲得其中的分泌蛋白成分。目前，分離蛋白的較有效的方法是分子膜法。在根系分泌物研究中廣泛應用的便是分子膜與超速離心分離技術。不同分子量的分子膜孔徑一般介于0.001～1.000 μm之間。利用分子膜結合超濾濃縮技術，可將根系分泌物細菌、雜質甚至病毒和蛋白質、氨基酸及多肽有效地分離開來，在分離出分泌蛋白的同時防止微生物對根系分泌物的降解［52］。

2.2 根系分泌蛋白的定性定量分析 根系分泌蛋白是根系分泌物中的一種重要的成分。常見的根系分泌蛋白主要是一些酶類物質。根系分泌物中存在大量的酶，如轉化酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶、RNA酶和DNA酶等。它們對修飾土壤起一定的作用，如番茄根釋放磷酸酶、玉米根釋放水解酶。植物根系分泌蛋白對植物正常的生長發育有重要的作用。因此，分泌蛋白組的研究是國內外學者近年來研究探索的重要領域。這是由于分泌蛋白組不同于組織和細胞蛋白質組，其分泌量低，干擾物多，又受收集、濃縮等過程的限制［53］。目前，關于植物根系分泌蛋白的報道還相對較少。

根系分泌蛋白主要通過以下方法來鑒定。植物蛋白質組學研究中最常用的方法是雙向電泳與質譜聯用［54］，但由于該方法要求上樣量大，低豐度蛋白質難以檢測，所以不適合分析、鑒定植物根系分泌的量少且干擾物質多的分泌蛋白。傳統的Edman降解法測定的肽序列準確，雖然測定肽段序列的速度較慢，花費較高，但目前依然是一種可靠的鑒定蛋白質的方法。隨著Edman降解法在微量測序等方面的重大突破，它在蛋白質組學研究中仍發揮著重要作用［55］。生物質譜技術具有極高的靈敏度和高能量。它是把樣品分子離子化后，根據不同離子間的質荷比(m/z)的差異來分離且確定相對分子量，采用生物質譜技術鑒定蛋白質主要是根據蛋白質酶解后的肽質量指紋圖譜和肽序列信息去搜索蛋白質或核酸序列庫［56］。鳥槍法(Shotgun)則是運用生物質譜技術，并且集成2種或2種以上色譜分離鑒定技術實現對蛋白質混合物的高通量分離鑒定。Shotgun技術的關鍵是對獲得的全蛋白進行全酶切，得到多肽混合物，之后對其進行兩維或多維色譜分離在線串聯質譜分析［54］，然后通過蛋白質數據庫檢索，從而鑒定蛋白質。馬瑋等［57］運用Shotgun技術共鑒定得到玉米根系分泌物中的2 848個蛋白，獲得較完整的玉米根系分泌蛋白圖譜。Shotgun技術具有更高的靈敏性，更適合對低豐度蛋白質、干擾物多的植物根系分泌蛋白組進行鑒定，并且能夠獲得完整、可靠的蛋白質組表達信息。

2.3 生物信息學對根系分泌蛋白的預測與分析 近年來，隨著計算機技術和互聯網技術的快速發展，各類生物信息學軟件及各類分子生物信息學數據庫不斷涌現，并且在生命科學領域中的作用日益廣泛。與測定蛋白質的細胞定位不同，生物信息學方法利用多種序列分析程序，根據蛋白序列的編碼特征，可以實現蛋白質亞細胞定位的高通量分析。對于分泌蛋白的生物信息學鑒定方法，目前常應用三類軟件的組合分析，來預測一個蛋白質的亞細胞定位及其可能的分泌途徑。目前常用的用于分泌蛋白預測的軟件列于表1。蘇源等［68］應用信號肽分析軟件SignalP v3.0、亞細胞定位預測軟件TargetP 1.1、GPI錨定位點預測軟件big-PI Predictor和跨膜螺旋分析軟件TMHMM2.0等4個軟件分析了稻瘟菌12 595個蛋白序列，發現有1 134個為分泌蛋白(約占全部蛋白的9%)，其中435個分泌蛋白有功能注釋，主要是代謝相關的酶類，其中細胞壁組分降解相關的酶有45個，還有相當數量的酶與致病相關。SUBA3是由澳大利亞西澳大學(University of Western Austrilia)計算系統生物學中心創建、維護的擬南芥蛋白亞細胞定位數據庫(SUBA3，SUBcellular location of proteins in Arabidopsis)。該數據庫創建于2007年。亞細胞定位的信息來自于通過實驗測定的亞細胞定位數據和利用生物信息學軟件預測分析的數據。最新版本的數據庫中亞細胞定位信息涉及22個預測分析程序，分別是Ada-Boost、ATP、BaCelLo、ChloroP 1.1、EpiLoc 、iPSORT、MitoPred、MitoProt、MultiLoc2、Nucleo、PCLR 0.9、Plant-mPLoc 、PProwler 1.2、Predotar v1.03、PredSL 、PTS1、SLPFA、SLP-Local、Sub-Loc、TargetP 1.1、WoLF PSORT 和 YLoc，可見生物信息學軟件在分泌蛋白預測分析中具有越來越重要的作用［69］。

表1 應用于植物分泌蛋白預測分析的主要生物信息學軟件

3 展望

根系作為植物生長發育不可缺少的重要器官，在養分與水分的吸收、土壤生物和非生物逆境(如病蟲害、干旱、淹水、養分缺乏、土壤污染、土壤酸化等)適應中發揮重要作用。了解不同生長條件下根系分泌蛋白的表達，對合理利用植物資源、提高作物產量與品質具有重要生產實踐意義。近年來，根系研究已成為植物科學研究領域中一個重要的研究方向。而了解根系蛋白分泌的調控作用和機制，從而將這些知識更好地運用于農業生產中，是農業生產中一個迫切的任務。目前科研人員面臨的挑戰在于弄清根系分泌中的運輸系統和調節機制，從而有助于我們更好地了解根系分泌的化合物以及它們在根際中的作用;另外一個重大挑戰是對根系分泌的低豐度蛋白的分離與鑒定，并且最終闡明其生物學功能。根系分泌蛋白為土壤中的微生物提供了氮源和能源物質。微生物活動所分泌的蛋白同樣對根系分泌蛋白研究進展產生一定的影響。那么，相應的無菌培養系統將會成為未來研究的新方向。傳統生態學方法與現代生物學技術結合，有助于闡明根系分泌物與根際微生物間的相互作用。

在蛋白組學日益發展的今天，它在根系分泌蛋白的分離、鑒定方面發揮著越來越重要的作用。比如，早在20世紀90年代中期，就報道了在植物中非經典分泌蛋白的存在，但只是近年來隨著蛋白組學技術的快速發展，大量的分泌蛋白才陸續被報道，并認為有高達70%的分泌蛋白是通過非經典途徑分泌的，也就是說，大部分分泌蛋白的胞外轉運是不依賴于經典的ER-Golgi途徑的［20］。因此，發展高能量的定量蛋白組學技術是快速鑒定根系分泌蛋白的重要技術保證。

僅以試驗手段去捕獲生物中重要分泌蛋白且做深入研究的效率是有限的，而通過生物信息學的手段高通量地獲悉生物中某一類型的蛋白，在此基礎上進一步篩選以獲得感興趣的蛋白，是一種簡單、高效的方法。目前，雖然大部分生物信息學軟件可以預測蛋白組中可能的分泌蛋白，但仍存在較高的假陽性。如何對其進行準確鑒定，并從中挑選出有意義的目標蛋白并且對其進行功能測定，是亟待解決的另一問題［70-71］。

另外，已知分泌蛋白多為病原微生物與植物受體蛋白起作用的激發子和其他致病因子。結合計算機技術和生物信息學的方法，深入研究分泌蛋白組學，有助于為全面掌握植物與病菌相互作用的分子機制。同時，對植物的根系逆境條件下分泌蛋白的抗性機制研究具有重要的實踐意義。

［1］殷博.幾種作物根系分泌物對土壤微生物的影響［D］.哈爾濱:黑龍江大學，2009.

［2］涂從，袁呂江，魏世強，等.土壤鉀營養狀況對作物根際分泌物的效應研究［J］.西南農業大學學報，1996，18(3):276-280.

［3］洪常青，聶艷麗.根系分泌物及其在植物營養中的作用［J］.生態環境，2003，12(4):508-511.

［4］郝乾坤.植物根系分泌物及其效應［J］.楊凌職業技術學院學報，2004，3(1):53-55.

［5］沈宏，嚴小龍.根分泌物研究現狀及其在農業與環境領域的應用［J］.農村生態環境，2000，16(3):51-54.

［6］GLEBA D，BORISJUK N V，BORISJUK L G，et al.Use of plant roots for phytoremediation and molecular farming［J］.PNAS，1999，96(11):5976-5977.

［7］WEN F，VANETTEN H D，TSAPRAILIS G，et al.Extracellular proteins in pea root tip and border cell exudates［J］.Plant Physiol，2007，143(2):773-783.

［8］SHINANO T，YOSHIMURA T，WATANABE T，et al.Effect of phosphorus levels on the protein profiles of secreted protein and root surface protein of rice［J］.J Proteome Res，2013，12(11):4748-4756.

［9］ZHANG L，TIAN L H，ZHAO J F，et al.Identification of an apoplastic protein involved in the initial phase of salt stress response in rice root by twodimensional electrophoresis［J］.Plant Physiol，2009，149(2):916-928.

［10］DRAKAKAKI G，DANDEKAR A.Protein secretion:How many secretory routes does a plant cell have?［J］.Plant Science，2013，203/204:74-78.

［11］GALILI G，SENGUPTA-GOPALAN C，CERIOTTI A.The endoplasmic reticulum of plant cells and its role in protein maturation and biogenesis of oil bodies［J］.Plant Mol Biol，1998，38:1-29.

［12］張海婧，劉輝，呂麗艷，等.分泌蛋白質組研究進展［J］.分析化學，2007，35(6):912-918.

［13］GARDELLA S，ANDREI C，FERRERA D，et al.The nuclear protein HMGB1 is secreted by monocytes via a non-classical，vesicle-mediated secretory pathway［J］.EMBO Reports，2002，3(10):995.

［14］ORCI L，TAGAYA M，AMHERDT M，et al.Brefeldin A，a drug that blocks secretion，prevents the assembly of non-clathrin-coated buds on Golgi cisternae［J］.Cell，1991，64(6):1183-1195.

［15］CLEVES A E.Protein transports:thenonclassical ins and outs［J］.Curr Biol，1997，7(5):318-320.

［16］HUGHERS R C.Secretion of the galectin family of mammalian carbohydrate-binding proteins［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1473(1):172-185.

［17］WAKISAKA N，MURONO S，YOSHIZAKI T，et al.Epstein-barr virus latent membrane protein 1 induces and causes release of fibroblast growth factor-2［J］.Cancer Res，2002，62(21):6337-6344.

［18］LUTOMSKI D，FOUILLIT M，BOURIN P，et al.Externalization and binding of galectin-1 on cell surface of K562 cells upon erythroid differentiation［J］.Glycobiology，1997，7(8):1193-1199.

［19］MAIZEL A，TASSETTO M，FILHOL O，et al.Engrailed homeoprotein secretion is a regulated process［J］.Development，2002，129(15):3545-3553.

［20］DING Y，ROBINSON D G，JIANG L.Unconventional protein secretion(UPS)pathways in plants［J］.Curr Opin Cell Biol，2014，29:107-115.

［21］AN Q，EHLERS K，KOGEL K H，et al.Multivesicular compartments proliferate in susceptible and resistant MLA12-barley leaves in response to infection by the biotrophic powdery mildew fungus［J］.New Phytol，2006，172:563-576.

［22］AN Q，HüCKELHOVEN R，KOGEL K H，et al.Multivesicular bodies participate in a cell wall associated defence response in barley leaves attacked by the pathogenic powdery mildew fungus［J］.Cell Microbiol，2006，8:1009-1019.

［23］TSE YC，MO B，HILLMER S，et al.Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells［J］.Plant Cell，2004，16:672-693.

［24］WANG W，WEN Y，BERKEY R，et al.Specific targeting of the Arabidopsis resistance protein RPW8.2 to the interfacial membrane encasing the fungal haustorium renders broad-spectrum resistance to powdery mildew［J］.Plant Cell，2009，21:2898-2913.

［25］SCHEURING D，VIOTTI C，KRüGER F，et al.Multivesicular bodies mature from the trans-golgi network/early endosome in Arabidopsis［J］.The Plant Cell，2011，23:3463-3481.

［26］黃歡，李萬杰，楊冬.ESCRT系統:一個多功能的蛋白轉運及膜剪切機器［J］.中國生物化學與分子生物學報，2013，29(2):99-109.

［27］NIELSEN M E，FEECHAN A，BOHLENIUS H，et al.Arabidopsis ARFGTP exchange factor，GNOM，mediates transport required for innate immunity and focal accumulation of syntaxin PEN1［J］.PNAS，2012，109:11443-11448.

［28］RAPOSO G，STOORVOGEL W.Extracellular vesicles:exosomes，microvesicles，and friends［J］.J Cell Biol，2013，200:373-383.

［29］REGENTE M，CORTI-MONZON G，MALDONADO A M，et al.Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins［J］.FEBS Lett，2009，583:3363-3366.

［30］PINEDO M，REGENTE M，ELIZALDE M，et al.Extracellular sunflower proteins:evidence on non-classical secretion of a jacalin-related lectin［J］.Protein Pept Lett，2012，19:270-276.

［31］PRADO N，ALCHé JDE D，CASADO-VELA J，et al.Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth:a possible role in fertilization［J］.Mol Plant，2014，7:573-577.

［32］SAFAVIAN D，GORING D R.Secretory activity is rapidly induced in stigmatic papillae by compatible pollen，but inhibited for self-incompatible pollen in the Brassicaceae［J］.PLOS ONE，2013，8:84286.

［33］IRENE K，STEFAN H，GOTTHARD K.Klaus M:Brefeldin A differentially affects protein secretion from suspension-cultured tobacco cells(Nicotiana tabacum L.)［J］.J Plant Physiol，1995，146:71-80.

［34］KUNZE I，KUNZE G，RAMM S，et al.Two polypeptides that are secreted from suspension-cultured tobacco cells in the presence of Brefeldin A have chitin-binding domains［J］.J Plant Physiol，1995，147:63-70.

［35］CHENG F，ZAMSKI E，GUO W，et al.Salicylic acid stimulates secretion of the normally symplastic enzyme mannitol dehydrogenase:a possible defense against mannitol-secreting fungal pathogens［J］.Planta，2009，230:1093-1103.

［36］ZHANG H，ZHANG L，GAO B，et al.Golgi apparatus-localized synaptotagmin 2 is required for unconventional secretion in Arabidopsis［J］.PLoS ONE，2011，6:26477.

［37］HATSUGAI N，IWASAKI S，TAMURA K，et al.A novel membrane fusionmediated plant immunity against bacterial pathogens［J］.Genes Dev，2009，23:2496-2506.

［38］HARA-NISHIMURA I，HATSUGAI N.The role of vacuole in plant cell death［J］.Cell Death Differ，2011，18:1298-1304.

［39］TERBUSH D R，MAURICE T，ROTH D，et al.The Exocyst is a multiprotein complex required for exocytosis in Saccharomyces cerevisiae［J］.EMBO J，1996，15:6483-6494.

［40］HSU S C，TING A E，HAZUKA C D，et al.The mammalian brain rsec6/8 complex［J］.Neuron，1996，17:1209-1219.

［41］ELIAS M，DRDOVA E，ZIAK D，et al.The exocyst complex in plants［J］.Cell Biol Int，2003，27:199-201.

［42］HEIDER M.Munson M:Exorcising the exocyst complex［J］.Traffic，2012，13:898-907.

［43］SYNEK L，SCHLAGER N，ELIAS M，et al.AtEXO70A1，a member of a family of putative exocyst subunits specifically expanded in land plants，is important for polar growth and plant development［J］.Plant J，2006，48:54-72.

［44］CVRC-KOVá F，GRUNT M，BEZVODA R，et al.Evolution of the land plant exocyst complexes［J］.Front Plant Sci，2012，3:159.

［45］ZARSKY V，KULICH I，FENDRYCH M，et al.Exocyst complexes multiple functions in plant cells secretory pathways［J］.Curr Opin Plant Biol，2013，16:726-733.

［46］FENDRYCH M，SYNEK L，PECENKOVA T，et al.Visualization of the exocyst complex dynamics at the plasma membrane of Arabidopsis thaliana［J］.Mol Biol Cell，2013，24:510-520.

［47］HALA M，COLE R，SYNEK L，et al.An exocyst complex functions in plant cell growth in Arabidopsis and tobacco［J］.Plant Cell，2008，20:1330-1345.

［48］WANG J，DING Y，WANG J，et al.EXPO，an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes，mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells［J］.Plant Cell，2010，22:4009-4030.

［49］PRONIN V A，VORONKOVA F V.The technique for investigation of root exudates of higher plants［J］.Fiziologiya-Rastenii，1973，20(1):210-214.

［50］TANG C S，YOUNG C C.Collection and identification of allelopathic compounds from the undisturbed root system of Bigalta limpograss(Hemarthria altissima)［J］.Plant Physiol，1982，69(1):155-160.

［51］劉秀芬，馬瑞霞，袁光林，等根際區他感化學物質的分離、鑒定與生物活性的研究［J］.生態學報，1996，16(1):1-10.

［52］劉芷宇，李良謨，施衛明，等.根際研究法［M］.南京:江蘇科學技術出版社，1997.

［53］CHEVALLET M，DIEMER H，VAN DORSSEALER A，et al.Toward a better analysis of secreted proteins:the example of the myeloid cells secretome［J］.Proteomics，2007，7(11):1757-1770.

［54］BASU U，FRANCIS J L，WHITTAL R M，et a1.Extracellular proteomes of Arabidopsis thaliana and Brassica napus roots:Analysis and comparison by MudPIT and LC-MS/MS［J］.Plant Soil，2006，286(1):357-376.

［55］GEVAERT K，VANDEKERCKHOVE J.Protein identification methods in proteomics［J］.Electrophoresis，2000，21(6):1145-1154.

［56］李坤朋.不同基因型玉米對磷脅迫的反應及根系蛋白質組學研究［D］.濟南:山東大學，2007:21-24.

［57］馬瑋，HOCHHOLDINGER F，李春儉.用不同蛋白質分析方法鑒定玉米分泌蛋白組的比較研究［J］.光譜學與光譜分析，2010，30(10):2762-2766.

［58］HILLER K，GROTE A，SCHEER M，et al.PrediSi:prediction of signal peptides and their cleavage positions［J］.Nucleic Acids Res，2004，32:375-379.

［59］PETERSEN T N，BRUNAK S，VON HEIJNE G，et al.SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions［J］.Nature Methods，2011，8:785-786.

［60］KROGH A，LARSSON，B，VON HEIJNE G，et al.Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model:Application to complete genomes［J］.Journal of Molecular Biology，2001，305(3):567-580.

［61］EMANUELSSON O，BRUNAK S，VON HEIJNE G，et al.Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP，and related tools［J］.Nature Protocols，2007，2:953-971.

［62］HIROKAWA T，BOON-CHIENG S，MITAKU S.SOSUI:classification and secondary structure prediction system for membrane proteins［J］.Bioinformatics，1998，14(4):378-379.

［63］BRIESEMEISTER S，RAHNENF HRER J，KOHLBACHER O.YLoc—an interpretable web server for predicting subcellular localization［J］.Nucleic Acids Res，2010，38:497-502.

［64］HORTON P，PARK K J，OBAYASHI T，et al.WoLF PSORT:protein localization predictor［J］.Nucleic Acids Res，2007，35:585-587.

［65］PIERLEONI A，MARTELLI P L，FARISELLI P，et al.BaCelLo:a balanced subcellular localization predictor［J］.Bioinformatics，2006，22(14):408-416.

［66］TANG S，LI T，CONG P，et al.PlantLoc:an accurate web serverfor predicting plant protein subcellular localization by substantiality motif［J］.Nucleic Acids Res，2013，41:441-447.

［67］LIU L，ZHANG Z，MEI Q，et al.PSI:comprehensive and integrative approach for accurate plant subcellular localization prediction［J］.PLoS One，2013，8(10):75826.

［68］蘇源，李成云，趙之偉，等.稻瘟菌基因組規模分泌蛋白的預測分析［J］.云南農業大學學報，2006，21(3):271-276，292.

［69］TANZ S K，CASTLEDEN I，HOOPER C M，et al.SUB A3:a database for integrating experimentation and prediction to define the SUB cellular location of proteins in Arabidopsis［J］.Nucleic Acids Res，2013，41:1185-1191.

［70］GUERRERA I C，KLEINER O.Application of mass spectrometry in proteomics［J］.Bioscience Report，2005，25(1/2):71-93.

［71］KRATCHMAROVA I，KALUME D E，BLAGOEV B，et al.A proteomic approach for identification of secreted proteins during the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes to adipocytes［J］.Mol Cell Proteomics，2002，1(3):213-222.