Ku70與hTERT在胃癌組織中的表達(dá)及其意義

， ，，

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科；4.南華大學(xué)腫瘤研究所)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

Ku70與hTERT在胃癌組織中的表達(dá)及其意義

胡華1，陽帥2，周建斌3，梁曉秋4*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科；4.南華大學(xué)腫瘤研究所)

目的探討Ku70和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)蛋白表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及兩者之間的聯(lián)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測Ku70和hTERT蛋白在10例正常胃黏膜、15例胃癌前病變黏膜和20例胃癌組織中的表達(dá)。結(jié)果Ku70蛋白陽性表達(dá)定位于正常胃黏膜和胃癌組織的細(xì)胞核，胃癌前病變黏膜的細(xì)胞漿，其陽性表達(dá)率分別為90%、100%和80%；hTERT蛋白在正常胃黏膜幾乎不表達(dá)，在胃癌前病變黏膜和胃癌組織中均定位于細(xì)胞漿，其陽性表達(dá)率分別為30%、100%和100%。胃癌組織中Ku70和hTERT蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常胃黏膜和胃癌前病變黏膜。Ku70和hTERT蛋白的表達(dá)顯著相關(guān)。結(jié)論Ku70和hTERT蛋白可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)。

Ku70； 胃癌； 免疫組織化學(xué)

人類Ku70蛋白由609個氨基酸組成，分子量約69 581 Da,其編碼基因位于22q13。Ku70蛋白作為DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的調(diào)節(jié)亞單位，廣泛參與了DNA雙鏈斷裂修復(fù)、V(D)J重組、細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控、端粒長度和結(jié)構(gòu)維持以及某些細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。鑒于Ku70蛋白功能的多樣性，其與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已引起重視。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的催化亞單位，可以直接反映端粒酶活性的高低，從而影響端粒功能，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。本文檢測了Ku70與hTERT蛋白在正常胃黏膜、胃癌前病變黏膜和胃癌組織中的表達(dá)，以探討兩者與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

10例正常胃黏膜、15例胃癌前病變黏膜和20例胃癌組織均取自南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本。20例胃癌均為腺癌；低分化12例，高中分化8例。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療，病理組織類型根據(jù)《消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類(第四版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)分類[2]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

每一石蠟塊連續(xù)切片3張，厚度4 μm,一張常規(guī)HE染色，再次病理證實(shí)。另兩張常規(guī)脫蠟水化,采用枸櫞酸緩沖液煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)后按SP試劑盒(購自福建邁新生物技術(shù)公司)說明書進(jìn)行操作。第一抗體為：兔抗人Ku70多克隆抗體(購自Santa Cruz Biotechnology USA)，工作濃度為1∶80；兔抗人hTERT多克隆抗體(購自Santa Cruz Biotechnology USA)，工作濃度為1∶200，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

1.3 結(jié)果判定

以表達(dá)Ku70與hTERT的乳腺癌組織作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。由2個不同的病理醫(yī)生閱片計分，取平均值。每張切片觀測10個高倍鏡視野，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量統(tǒng)計：無陽性細(xì)胞，計0分；陽性細(xì)胞數(shù)1%～25%，計1分；26%～50%計2分；51%～75%記3分；76%～100%記4分。再根據(jù)陽性著色強(qiáng)度依次計0、1、2、3分(不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)，每張切片進(jìn)行2項分?jǐn)?shù)累計，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中陽性(++)，5～7分為強(qiáng)陽性(+++)[3]。

1.4 統(tǒng)計方法

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的χ2檢驗(yàn)或四格表確切概率檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異具有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ku70蛋白在正常胃黏膜、胃癌前病變黏膜和胃癌組織中的表達(dá)

正常胃黏膜Ku70蛋白定位于細(xì)胞核，陽性率90%(9/10)，其中弱陽性占70%，中陽性占20%，無強(qiáng)陽性表達(dá)；胃癌前病變黏膜Ku70蛋白定位于細(xì)胞漿，陽性率80%(12/15)，其中弱陽性占53.3%，中陽性占26.7%，無強(qiáng)陽性表達(dá)；胃癌組織Ku70蛋白定位于細(xì)胞核，陽性率100%(20/20)，其中中陽性占5%，強(qiáng)陽性為95%。Ku70蛋白在這三種病變中的表達(dá)差異具有顯著性(P<0.001，表1及圖1)。

表1Ku70與hTERT蛋白在正常胃黏膜、胃癌前病變黏膜和胃癌組織中的表達(dá)(例，%)

組織分類nKu70表達(dá)-++++++hTERT表達(dá)-++++++正常胃黏膜101(10.0)7(70.0)2(20.0)0(0.0)7(70.0)2(20.0)1(10.0)0(0.0)胃癌前病變黏膜153(20.0)8(53.3)4(26.7)0(0.0)0(0.0)7(46.7)8(53.3)0(0.0)胃癌組織200(0.0)0(0.0)1(5.0)19(95.0)0(0.0)2(10.0)0(0.0)18(90.0)

圖1 Ku70蛋白在不同組織中的表達(dá)(SP 200×) A：正常胃黏膜；B：胃癌前病變黏膜；C：胃癌組織

2.2 hTERT蛋白在正常胃黏膜、胃癌前病變黏膜和胃癌組織中的表達(dá)

正常胃黏膜hTERT蛋白定位于細(xì)胞漿，陽性率30%(3/10)，其中弱陽性占20%，中陽性占10%，無強(qiáng)陽性表達(dá)；胃癌前病變黏膜hTERT蛋白定位于細(xì)胞漿，陽性率100%(15/15)，其中弱陽性占46.7%，中陽性占53.3%，無強(qiáng)陽性表達(dá)；胃癌組織hTERT蛋白定位于細(xì)胞漿，陽性率100%(20/20)，其中弱陽性占10%，強(qiáng)陽性為90%。hTERT蛋白在這三種病變中的表達(dá)差異具有顯著性(P<0.001，表1及圖2)。

圖2 hTERT蛋白在不同組織中的表達(dá)(SP 200×) A：正常胃黏膜；B：胃癌前病變黏膜；C：胃癌組織

2.3 胃癌中Ku70與hTERT蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

胃癌中Ku70與hTERT蛋白表達(dá)高低具有一致性(P<0.001，表2)。

表2胃癌中Ku70與hTERT蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

Ku70表達(dá)nhTERT表達(dá)(例,%)-～+++～+++-～+00(0.0)0(0.0)++～+++202(10.0)18(90.0)合計202(10.0)18(90.0)

3 討 論

胃癌是消化道最常見的腫瘤，其發(fā)病率占全球惡性腫瘤的第4位，其致死率位于癌癥相關(guān)死亡的第2位，嚴(yán)重威脅著人類的健康[4]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多因素影響、多階段和多步驟的過程。在遺傳和環(huán)境因子的作用下，經(jīng)歷了從正常胃黏膜向癌前病變、早期癌、浸潤癌、轉(zhuǎn)移癌的逐漸轉(zhuǎn)變。在此轉(zhuǎn)變過程中，基因組不穩(wěn)定和端粒功能失常是其重要機(jī)制。

基因組穩(wěn)定性的威脅主要來自各種內(nèi)外因子引起的DNA雙鏈斷裂(DSBs)。DSBs修復(fù)包括同源重組(HR)和非同源DNA末端連接(NHEJ)兩種，其中NHEJ是哺乳動物DSBs修復(fù)的主要方式,依賴于Ku蛋白的參與。在真核生物中，Ku是由70和80 kDa的兩個亞單位構(gòu)成的異二聚體，這兩個亞單位分別被稱作Ku70(在芽殖酵母中為Yku70和Hdf1)和Ku80(在芽殖酵母中為Yku80和Hdf2，在高等真核生物中稱作Ku86)。Ku異二聚體與DNA-PKcs結(jié)合形成DNA-PK，參與DNA損傷修復(fù)活動，進(jìn)而維持基因組的穩(wěn)定[5]。

端粒是真核生物線性染色體末端的核酸—蛋白質(zhì)復(fù)合體，其重要功能主要表現(xiàn)為保護(hù)染色體末端，以避免不正確的重組、融合和降解等改變。端粒功能的維持體現(xiàn)在對端粒長度和結(jié)構(gòu)的調(diào)控上。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)及相關(guān)蛋白組成，它以自身RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成端粒重復(fù)序列以維持端粒長度的穩(wěn)定性，從而防止細(xì)胞在復(fù)制分裂時因端粒的丟失而發(fā)生復(fù)制性的衰老或死亡。根據(jù)大量的研究發(fā)現(xiàn)，在幾乎所有的人類惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)端粒酶的強(qiáng)陽性表達(dá)，而在正常組織中端粒酶則呈陰性。TERT被普遍認(rèn)為是端粒酶的催化亞基，其表達(dá)水平與端粒酶活性水平成正比關(guān)系。

Ku缺陷的芽殖酵母對溫度敏感，當(dāng)其暴露于不適宜的生長溫度時，細(xì)胞由于端?？s短而死亡。在裂殖酵母，Ku缺陷可以使端粒縮短。人Ku缺陷引起端粒長度進(jìn)行性縮短，導(dǎo)致染色體融合，使基因組不穩(wěn)定的發(fā)生率增加。另外人Ku還可以與端粒酶的催化亞基結(jié)合。Ku也可以不依賴hTERT而與端粒酶RNA直接作用，從而維持端粒的完整性[7-8]。

Ku70與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已引起關(guān)注。有研究報道，在卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌中Ku70蛋白均呈高表達(dá)[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ku70在正常胃黏膜、胃癌前病變和胃癌中都有不同程度的表達(dá)，但胃癌組織中Ku70的表達(dá)明顯增強(qiáng)。Ku70蛋白的高表達(dá)可能是惡性腫瘤的共同特征。而且，Ku70在正常胃黏膜和胃癌中定位于細(xì)胞核，在胃癌前病變中則定位于細(xì)胞漿，提示Ku70蛋白的轉(zhuǎn)位可能也參與了胃癌的形成，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。與此同時，筆者發(fā)現(xiàn)胃癌組織中hTERT蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常胃黏膜和胃癌前病變黏膜，并且與Ku70蛋白的表達(dá)具有高度一致性，提示Ku70與hTERT密切相關(guān)，Ku70有可能促進(jìn)了hTERT的表達(dá)進(jìn)而影響端粒功能參與胃癌發(fā)生發(fā)展的過程。

盡管Ku70最初是在一些自身免疫性疾病患者血清中發(fā)現(xiàn)的，但其生物功能的多樣性，決定了其在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的特殊作用。本文中Ku70通過端粒調(diào)控途徑參與胃癌的形成，這有可能為胃癌的預(yù)防和治療提供新的方向和作用靶點(diǎn)。

[1] Kovalenko NA,Zhdanov DD,Kovalenko TF.Possibilities and effects of telomerase activation[J].Mol Biol (Mosk),2013,47(4):544-557.

[2] 崔全才,孟宇宏,王魯平.消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012:56-70.

[3] Oh BK,Kim YJ,Park C,et al.Up-regulation of telomere-binding protins,TRF1,TRF2,and TIN2 is related to telomere shortening during humanmultistep hepatocarcinogenesis[J].Am J Pathol,2005,166(1):73-80.

[4] Jayavelu ND,Bar NS.Metabolomic studies of human gastric cancer[J].World J Gastroenterol,2014,20(25):8092-8101.

[5] Ju YJ,Lee KH,Park JE,et al.Decreased expression of DNA repair proteins Ku70 and Mre11 is associated with aging and may contribute to the cellular senescence[J].Exp Mol Med,2006,38(6):686-693.

[6] 何晉,陳曉彬,鄭昭芬,等.C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老及非諾貝特的保護(hù)作用[J].中國動脈硬化雜志,2012,20(1):42-46.

[7] Armstrong CA,Pearson SR,Amelina H,et al.Telomerase Activation after Recruitment in Fission Yeast[J].Curr Biol,2014,24(17):2006-2011.

[8] Kotsopoulos J,Prescott J,De Vivo I，et al.Telomere Length and Mortality Following a Diagnosis of Ovarian Cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2014 Aug 26.pii:cebp.0885.2014.[Epub ahead of print]

[9] 由衛(wèi)芝,申愛方,張玲,等.卵巢上皮性腫瘤組織中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(7):46-48.

[10] 黃錦坤,吳文啟,梁葉萍,等.Ku70蛋白在前列腺癌中表達(dá)的臨床研究[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志,2012,4(2):105-107.

ExpressionofKu70andhTERTinHumanGastricCancerandtheClinicalSignificance

HU Hua,YANG Shuai,ZHOU Jianbin,et al

(DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explore the relationship of Ku70 and hTERT protein expressions in the progression of human gastric carcinogenesis and their correlations.MethodsExpressions of Ku70 and hTERT protein in 10 normal gastric mucosa,15 precancerous lesions and 20 gastric cancers were examined by immunohistochemistry.ResultsKu70 was found in normal gastric mucosa with mild nuclear expression,in precancerous lesion with mild cytoplasmic expression and in GC with marked nuclear expression and its positive expression rates were 90%,80% and 100% respectively.hTERT was found in cytoplasm and its positive expression rates in normal gastric mucosa,precancerous lesion and gastric cancer were respectively 20%,100% and 100%.The staining densities of Ku70 and hTERT protein in gastric cancer tissues were significantly higher than that in normal gastric mucosa and precancerous lesions.There was a significant correlation between the expressions of Ku70 and hTERT.ConclusionKu70 and hTERT protein protein might play an important role in the progression of human gastric carcinogenesis.

Ku70; Gastric cancer; Immunohistochemistry

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.008

2014-08-09；

2014-11-20

*通訊作者，E-mail:liangxiaoqiu368@aliyun.com.

R735.2

A

(此文編輯：蔣湘蓮)