薺菜多糖的分離純化與單糖組成分析

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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所)

·技術(shù)與方法·

薺菜多糖的分離純化與單糖組成分析

王華1，熊淑娟2，曹軒2，陳臨溪2，唐國(guó)濤2

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所)

目的對(duì)薺菜多糖進(jìn)行分離純化并分析其單糖組成。方法采用超聲法提取總多糖，除蛋白，用SephadexG-75進(jìn)行純化，水解后用氣相色譜分析其單糖組成。結(jié)果分離得到兩個(gè)多糖組分1和2。氣相色譜鑒定出其中四種單糖組成，D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露醇和D-葡萄糖，其組成比例為1:1.8:270.8:1。結(jié)論從薺菜多糖中分離出兩種多糖組分，組分2由8種多糖組成，鑒定出其中4種。

薺菜多糖； 分離純化； 單糖組成； 氣相色譜

薺菜(Shepherdspurse Herb)，始載于《千金食治》為十字花科植物薺菜的帶根全草。薺菜為藥食同源植物，江南有三月三吃薺菜的習(xí)俗。薺菜的藥用價(jià)值很高，全株入藥，具有明目、清涼、解熱、利尿、治痢等藥效，其花與籽可以止血[1,3]。薺菜多糖是薺菜的主要有效成分之一，多糖具有多種生物功能，如增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等[4]。薺菜多糖對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌有一定的抑制作用[5]，另外具有一定的清除氧自由基的作用[6]。

對(duì)薺菜多糖的成分分析，還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)薺菜多糖進(jìn)行了分離純化，通過(guò)氣相色譜法對(duì)照已知單糖氣相色譜峰確定多糖中單糖的組分，并計(jì)算其摩爾比，為薺菜多糖的合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)單糖(科密歐、Blosharp、aladdin公司)，4 mol/L三氟乙酸，甲醇，氫氧化鈉，硼氫化鈉，三甲基氯硅烷，六甲基二硅醚烷，吡啶，分子篩。所用試劑皆為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

安剖瓶，氮吹儀，恒溫水浴箱，HP-5石英毛細(xì)管色譜柱，超低溫冷凍儲(chǔ)存箱(中科美菱)；AR2140型電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；6890N Network GC System氣相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；TD25型低速離心機(jī)(沙平凡儀器儀表有限公司)；XMTD-8222型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)(京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 稱取薺菜藥材粉末30 g，加4倍量95%乙醇回流提取脫脂，藥渣加300 mL蒸餾水超聲1 h，過(guò)濾，離心，取上清液，得粗多糖提取液。

1.2.2 多糖的純化 多糖提取液通過(guò)木瓜蛋白酶法脫蛋白[7]，透析，離心，上清液加入乙醇使之體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%，離心得沉淀，沉淀用水配制成濃度為5%的多糖溶液，離心，上清液用Sephadex G-75層析柱分離( 2.6 mm× 40 cm)，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，洗脫液用自動(dòng)收集儀收集( 每管4 mL)，分別收集洗脫液，透析，凍干，計(jì)算產(chǎn)率。

1.2.3 多糖的成分測(cè)定 (1)多糖的水解：1 mg的多糖樣品(組分2)溶解在2 mL的4 mol/L的TFA溶液中，充氮?dú)饧由w密封，置100 ℃水解6 h。然后用氮?dú)獬?2)單糖的還原：水解糖樣品溶解在0.5 mL的0.05 mol/L氫氧化鈉溶液中，加入10 mg的硼氫化鈉，在60 ℃還原1 h。加乙酸至無(wú)氣泡逸出為止。用氮?dú)獬ニ?，加? mL甲醇并振蕩溶解后，用氮?dú)獬ゼ状?。這樣反復(fù)5次以除去硼酸根。殘?jiān)诶鋬龈稍餀C(jī)中干燥6 h[8]。(3)單糖的甲基化：干燥物加入1 mL 4A分子篩干燥的吡啶，振蕩使其溶解，再依次加入0.5 mL六甲基二硅醚烷和0.2 mL的三甲基氯硅烷，振蕩，混合均勻，置于4 ℃冰箱中反應(yīng)12 h，使其充分反應(yīng)，完全衍生成糖的三甲基硅醚衍生物。離心機(jī)離心8 min(4 000 r/min)，取上清液，進(jìn)行GC分析。(4)氣相色譜分析：氣相色譜條件為：HP-5石英毛細(xì)管色譜柱(50 m×0.22 mm，0.25 μm)；EI源，電子能量70 eV，分子量掃描范圍33～550，柱箱溫度130～290 ℃，每分鐘升高10 ℃，進(jìn)樣口溫度295 ℃，載氣氮?dú)饬魉?.2 mL/min，分流比50∶1，檢測(cè)器溫度300 ℃。在此方法下對(duì)各糖樣進(jìn)行檢測(cè)并得到相關(guān)的氣相色譜圖。

3 結(jié) 果

3.1 多糖組分的分離

經(jīng)過(guò)柱層析，自動(dòng)收集儀收集(每管4 mL)，苯酚—硫酸法顯色，以洗脫管數(shù)-吸光度值( A) 繪制洗脫曲線( 見(jiàn)圖1) 。根據(jù)曲線，分別收集洗脫液，透析，凍干，得到多糖組分1和2，從圖中可以看出薺菜多糖明顯分為2個(gè)洗脫峰，之后趨于平緩，說(shuō)明多糖已完全洗脫下來(lái)，兩個(gè)峰對(duì)稱性較好，說(shuō)明其均一性較好，可能為均一多糖。共含量分別為1.83%和5.62%。

圖1 薺菜多糖經(jīng)Sephadex G-75層析柱洗膠曲線

3.2 單糖組成的測(cè)定

取9種單糖對(duì)照品10 mg，按上述方法甲基化，得到的反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表1。表中保留時(shí)間是鑒定單糖種類的主要標(biāo)準(zhǔn)，峰面積[S]用來(lái)計(jì)算單糖含量。從表1中可知，幾種主要單糖的保留時(shí)間相對(duì)集中，時(shí)間段為8～11分鐘，在該段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的為各單糖的特征峰。本次實(shí)驗(yàn)中D-果糖和D-山梨醇存在兩組數(shù)據(jù)，其余單糖均有一組數(shù)據(jù)。

將標(biāo)準(zhǔn)單糖混合后進(jìn)行氣相分析，所得結(jié)果見(jiàn)圖2。數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

將薺菜多糖水解甲基化后進(jìn)行氣相分析，所得結(jié)果見(jiàn)圖3。數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

3.3 結(jié)果分析

將標(biāo)準(zhǔn)糖與薺菜多糖的氣相圖譜與數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比析，可分析出薺菜多糖的水解產(chǎn)物中含有四種已知的單糖成分，這四種單糖分別為D-木糖，L-鼠李糖，D-甘露醇，D-葡萄糖。分別對(duì)應(yīng)圖中的四個(gè)峰值，其一一對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表4。

表1單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)糖樣氣相色譜數(shù)據(jù)

單糖名稱保留時(shí)間[min]峰寬[min]峰面積[PA*S]峰高[PA]峰面積[S]D-阿拉伯糖8.4580.03813178.113192.406D-半乳糖10.6670.04273437.154791156.756711.69781D-甘露糖10.5070.0470926.09692291.934570.65494D-果糖10.5220.0669526.76135108.098040.0942210.5960.0344163.452621035.01340.02924D-木糖8.3530.04106491.192382294.647711.80188D-葡萄糖10.6100.04231501.07361541.765440.83070D-山梨醇10.5130.0724801.91815154.791900.5788810.5970.0363451.48413200.355740.32591L-鼠李糖8.9480.03844915.950681883.888181.60942甘露醇10.5310.31159209.92578358.730161.69172

圖2 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液氣相色譜

表2單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)糖混合后的氣相色譜數(shù)據(jù)

出峰順序保留時(shí)間類型峰寬[min]峰面積[PA*S]峰高[PA]峰面積18.306BV0.0388425.62576172.288450.0530328.426VV0.05071063.27002290.590450.1324738.751BV0.045563.9558121.030360.0079748.997VV0.1335319.0282330.640820.03975510.098VV0.0823213.1542738.663860.02656610.389VV0.0691326.2425566.619970.04064710.542VBAS0.16552965.21509231.442630.36942

圖3 薺菜多糖氣相色譜

表3薺菜多糖氣相色譜數(shù)據(jù)

出峰順序保留時(shí)間類型峰寬[min]峰面積[PA*S]峰高[PA]峰面積18.365BB0.03493.698311.730640.0013628.848BV0.05506.020341.495080.0022238.948VV0.09736.555461.043320.0024249.053VB0.08567.579981.169950.0027959.880BV0.303698.939483.932070.03646610.527VBAS1.09151138.8972212.285700.41971710.790BVT0.06126.606161.705660.00243811.308VVT0.03752.795331.105040.00103

表4薺菜多糖分析出4種單糖組成及摩爾比值

單糖成分出峰順序摩爾數(shù)(μmol)比例D-木糖10.054821.0L-鼠李糖30.099841.8D-甘露醇614.84465270.8D-葡萄糖70.057281.0

4 討 論

多糖的提取有多種方法[9]，有水提，堿水提取，單一或復(fù)合酶提取，超聲波提取，雙水相萃取，微波輔助提取等多種提取方法。本實(shí)驗(yàn)采超聲波提取法，提取效率高，時(shí)間短[10]。多糖除蛋白的方法選擇木瓜蛋白酶除蛋白，其蛋白去除率及多糖保留率較高[7]。多糖的結(jié)構(gòu)分析手段很多，主要分為兩大類，即化學(xué)分析法和物理分析法，本實(shí)驗(yàn)主要采用氣相色譜分析了薺菜多糖的單糖組成，由于標(biāo)準(zhǔn)單糖的樣品有限，我們只做了常見(jiàn)九種標(biāo)準(zhǔn)單糖，薺菜多糖的GC色譜圖上有8個(gè)峰，但對(duì)應(yīng)上的只有4種單糖，還有4個(gè)峰沒(méi)有找到對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)單糖，我們?cè)趯?duì)多糖進(jìn)行提取研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)薺菜多糖在堿性條件下在水中會(huì)析出，而在酸性條件下溶解，我們認(rèn)為可能其含有帶堿性的基團(tuán)，但從分析出的4種糖中，未發(fā)現(xiàn)有帶堿性的基團(tuán)。其余的幾種單糖組成需用更多的標(biāo)準(zhǔn)糖進(jìn)行對(duì)比分析。多糖的大小，連接的位置等還有待通過(guò)核磁共振，質(zhì)譜等做進(jìn)一步研究。

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Isolation,PurificationandMonosaccharideCompositionAnalysisofPolysaccharidefromShepherdspurseHerb

WANG Hua,XIONG Shujuan,CAO Xuan,et al

(TheFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

Objectiveto isolate and purify the polysaccharide and analyze the monosaccharide composition.Methodsthe polysaccharide extraction removing the proteins were purified through sephadex G75,the polysaccharide components were analyzed by gas chromatography(GC) after hydrolization.Relsultstwo monosaccharide components were obtained after purification.Four monosaccharide compositions concluding D-xylose,L-rhamnose,D-mannose and D-glucose were measured by GC in the second components and the proportion were 1∶1.8∶270.8∶1.Conclusiontwo polysaccharide fractions were isolated from Shepherdspurse Herb.The second fraction was composed of eight kinds of monosaccharide and four of them were identified.

Polysaccharide of Shepherdspurse Herb; isolation and purification; monosaccharide compositions; gas chromatography(GC)

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.021

2014-01-22；

2014-09-19

基金項(xiàng)目：湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(201162)

*通訊作者，E-mail:tqtzq@163.com

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(此文編輯：秦旭平)