維生素C對擠壓傷缺血/再灌注引起的心肌功能損傷的影響

2015-12-28 01:28:01邢兆國常軍英賈東昭王彥志李琦軍

河北醫科大學學報 2015年7期

邢兆國，常軍英，賈東昭，王彥志，李　炎，李琦軍

(河北省石家莊市第三醫院創傷一科，河北石家莊 050011)

邢兆國，常軍英，賈東昭，王彥志，李炎，李琦軍*

(河北省石家莊市第三醫院創傷一科，河北石家莊 050011)

[摘要]目的觀察維生素C(vitamin C，VitC)對大鼠擠壓綜合征(crush syndrome,CS)模型缺血/再灌注引起心肌損傷的改善情況，以及對生存率的影響。方法SD大鼠隨機分為對照組、CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組，復制CS模型，大鼠雙側后肢擠壓6 h，然后再灌注生理鹽水以及不同劑量VitC(10、20、40 mg/kg)6 h，收集血液用于生化分析，同時收集組織樣品用于RT-PCR與Western Blot分析。結果擠壓傷后CS組血鉀(K+)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌酸激酶心肌同功酶(creatine kinase MB,CK-MB)、血漿心鈉素(atrial natriuretic factor，ANP)較對照組升高，但CS組血鈣(Ca2+)、內皮素1(endothelin-1,ET-1)較對照組下降(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、20、40組K+、BUN、Cr、CK的含量顯著降低，Ca2+、ET-1含量顯著升高(P<0.05)。VitC-20組和VitC-40組的生存率高于CS組(P<0.05)。結論VitC對CS模型缺血/再灌注引起的心肌損傷具有細胞保護作用，并有助于提高大鼠CS模型的生存率。

[關鍵詞]擠壓綜合征;心肌再灌注損傷;抗壞血酸;大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.012

擠壓綜合征(crush syndrome,CS)是交通事故、地震、戰爭和恐怖襲擊等災害中的主要致死原因[1]。當大腿壓迫(缺血)1 h以上，然后解除壓力(再灌注)后引起肌細胞破裂即橫紋肌溶解[2]。外傷性橫紋肌溶解患者往往伴隨著血容量不足和血管通透性增加，有時會誘發高血壓和代謝性酸中毒。肢體擠壓傷對機體產生的影響是廣泛而復雜的[3]，在肢體缺血/再灌注時，細胞內的鉀離子通過破壞的細胞膜大量進入體循環，導致心臟驟停，高血鉀對心臟的損害最為嚴重，可直接導致心電紊亂，是CS常見的死因之一。在大鼠擠壓傷的早期，心肌細胞就存在一定程度的損傷[4]，這種損傷可能與血漿兒茶酚胺、血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ升高，血漿心鈉素(atrial natriuretic factor,ANP)、內皮素(endothelin,ET)-1濃度的改變有密切關系。目前，CS的推薦治療方案是生理鹽水及時補液，加入碳酸氫鹽和甘露醇糾正高鉀血癥。有研究報道，抗氧化劑和自由基清除劑[如維生素C(vitamin C，VitC)]可以治療和預防缺血/再灌注引起心律失常與全身性炎癥反應，但是明確的作用效果與作用機制還不十分清楚。本研究采用大鼠擠壓傷致股骨干骨折模型，系統比較擠壓傷大鼠與正常大鼠心功能指標的變化，觀察生理鹽水聯合VitC治療對擠壓傷后心臟損傷的改善情況，以便能更好地指導臨床。報告如下。

1材料與方法

1.1動物模型的建立與分組雄性SD大鼠140只購于河北省實驗動物中心，體質量250～300 g。其中40只隨機分為對照組、CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組各8只。對照組不擠壓；CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組均采用自制擠壓器械，壓力為3 kg，連續擠壓雙下肢6 h造成肢體擠壓傷后，再分別灌注生理鹽水以及不同劑量VitC(10、20、40 mg/kg)。另100例用于生存率的研究。

1.2血液和組織取樣分別從各組股動脈取血2 mL，應用全自動生化檢測儀，檢測血鉀(K+)、血鈣(Ca2+)、肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)以及肌酸激酶(creatine kinase,CK)的改變。應用ACS-180型自動化學發光系統，檢測肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)及肌酸激酶心肌同功酶(creatine kinase MB,CK-MB)濃度；應用放射免疫法檢測血漿內活性物質ANP、ET-1濃度。各組大鼠在取血后處死，打開胸腔，在心臟仍跳動時剪開心臟，取部分心肌應用光學顯微鏡觀察擠壓傷后不同時間段心肌組織光學病理變化情況；用RT-PCR和Western Blot技術，觀察心功能相關指標(如ANP和ET-1)的變化。

1.3心肌組織形態學觀察取部分心肌組織置于冷 PBS 中洗凈殘留血液，放入 10% 福爾馬林中固定至少24 h，乙醇梯度脫水，低溫石蠟垂直定向包埋，5 μm厚度連續切片，常規 HE 染色。并于光鏡下觀察、照相，進行圖像學分析。

1.4RT-PCR用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取總RNA，以此為模板，以Oligo(dT)16為引物，按照PE公司Taqman反轉錄試劑盒說明書合成互補脫氧核糖核酸 (complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)。以cDNA為模板，分別加入大鼠ANP、ET-1和c-Fos基因的引物，以GAPDH為內參照，按照PCR Kit說明書進行PCR。所用引物序列如下：ANP上游引物為5′-GGCTCCTTCTCCA-TCACCAA-3′，下游引物為5′-TGTTATCTTCGG-TACCG-3′；ET-1上游引物為5′-AACCATGGA-TTATTTGTCCATG-3′，下游引物為5′-AGTG-TTGACCCAAATGATGTCC-3′；c-Fos上游引物為 5′-CAGCCTTTCCTACTACCAT-3′，下游引物為5′-CCTATTCCTTTCCCTTCG-3′；GAPDH上游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.5Western印跡分析按常規方法收集和裂解細胞,取上清,用改良Lowry法進行蛋白定量。取等量的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE),半干法將分離膠上的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上; 以5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h,加入一抗4 ℃過夜,Tris鹽酸緩沖液洗膜后，以辣根過氧化物酶標記的IgG二抗37 ℃封閉2 h,增強化學發光法發光成像。

1.6生存率分析CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組大鼠各25只分別擠壓6 h后，觀察48 h再灌注的生存率。

2結果

2.1各組主要生化指標的變化擠壓傷后血清K+、BUN、Cr、CK較對照組升高(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清K+、BUN、Cr、CK的含量顯著降低(P<0.05)，并且呈劑量依賴關系。Ca2+則在解壓后與對照組比較有所下降，CS+VitC-10、-20、-40組血清 Ca2+的含量顯著升高，并且呈劑量依賴關系。見表1。

表1各組大鼠血清K+、Ca2+、BUN、Cr、CK比較

Table 1Serum K+,Ca2+,BUN,Cr and CK in rats of different groups

組別K+(mmol/L)Ca2+(mmol/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)CK(U/L)對照組5.28±0.372.96±0.478.652±1.18 64.96±10.222102.35±621.41 CS組11.27±1.97*1.49±0.59*29.47±6.21*199.98±24.03*15745.52±2643.36*CS+VitC-10組7.98±1.38*#1.89±0.38*#17.39±7.26*#102.72±20.14*#4576.63±1252.94*#CS+VitC-20組6.18±1.49*#△2.37±0.57*#△10.71±6.64#△89.68±18.93*#△2793.48±712.31*#△CS+VitC-40組5.79±1.56#△2.69±0.37*#△☆9.93±5.89#△78.01±15.62*#△☆2418.36±684.85#△ F22.54012.03917.45568.476135.271 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與CS組比較△P<0.05與VitC-10組比較☆P<0.05與VitC-20組比較(q檢驗)

2.2各組血清中cTnI、CK-MB 水平的改變擠壓傷后血清cTnI、CK-MB水平明顯升高(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清cTnI、CK-MB的含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2各組大鼠血清cTnI、CK-MB比較

Table 2Serum cTnI and CK-MB in rats of different groups

組別cTnI(μg/L)CK-MB(U/L)對照組0.45±0.19 2338.30±613.70CS組9.47±4.56*8951.56±1023.24*CS+VitC-10組4.19±1.56*#4021.87±983.79*#CS+VitC-20組1.78±0.34*#△2228.39±820.17#△CS+VitC-40組1.15±0.27*#△☆1952.38±648.43#△ F22.96599.177 P0.0000.000

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與CS組比較△P<0.05與VitC-10組比較☆P<0.05與VitC-20組比較(q檢驗)

2.3各組血漿、心肌組織中ANP、ET-1水平的改變大鼠血漿 ANP 含量在擠壓傷后上升，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清 ANP的含量顯著下降(P<0.05)。血清 ET-1 水平則在傷后 6 h 有所下降，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清ET-1的含量顯著升高(P<0.05)。見表3。

RT-PCR和Western印跡分析結果顯示，擠壓傷后心肌組織ANP mRNA與蛋白質水平較對照組均下降，而CS+VitC-10、-20、-40組心肌組織ANP mRNA與蛋白質水平均顯著升高。擠壓傷后心肌組織ET-1 mRNA與蛋白質水平較對照組均升高，而CS+VitC-10、-20、-40組心肌組織ET-1 mRNA與蛋白質水平均顯著降低(圖1)。

表3各組大鼠血清ANP、ET-1比較

Table 3Serum ANP and ET-1 in rats of different groups

組別ANPET-1對照組31.79±21.47 458.38±40.18 CS組78.08±34.32*298.28±64.87*CS+VitC-10組56.04±27.89*349.08±77.14*CS+VitC-20組38.32±22.37#421.98±47.18#△CS+VitC-40組34.50±25.54#437.78±43.16#△☆ F4.22411.361 P0.0070.007

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與CS組比較△P<0.05與VitC-10組比較☆P<0.05與VitC-20組比較(q檢驗)

圖1各組大鼠心肌組織中ANP與ET-1表達的變化

A.RT-PCR；B.Western Blot

Figure 1ANP and ET-1 expression in rat myocardium of different groups

2.4各組心肌光鏡 HE 染色結果對照組心肌組織正常，微細血管、心肌間質完好，細胞核呈卵圓形，位于細胞中央，核膜完整；CS組心肌組織水腫改變、肌間水腫加重，炎癥細胞有所增多；CS+VitC-10組心肌纖維腫脹程度較輕，少許纖維斷裂，心肌結構稍亂，出血，伴炎細胞浸潤；CS+VitC-20組，肌間水腫吸收，心肌纖維腫脹程度較輕，少許纖維斷裂，心肌結構稍亂(圖2)。

圖2各組心肌HE染色結果

A.對照組；B.CS組；C.CS+VitC-10組；D.VitC-20組

Figure 2HE staining in myocardium of rats in different groups

2.5各組大鼠生存率比較VitC-20組和VitC-40組的生存率高于CS組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4　各組大鼠生存率比較

*P<0.05與CS組比較#P<0.05與VitC-10組比較(χ2檢驗)

3討論

嚴重肢體擠壓傷后發生缺血/再灌注損傷，不僅造成擠壓部位的功能損傷，再灌注使擠壓部位的代謝毒性物質進入血液循環，影響循環系統血管內皮及心肌組織，相應可引起心臟功能損傷，可能有心力衰竭及其他改變。細胞內容物大量釋放入血,產生高鉀血癥、腎功能障礙，表現為血清BUN、Cr、K+濃度明顯升高[5]。本研究結果表明，擠壓傷后血清K+、BUN、Cr較對照組升高，說明擠壓后的確發生心肌繼發性損傷；但CS+VitC-10、-20、-40組血清K+、BUN、Cr、CK的含量顯著降低，且呈劑量依賴關系，說明VitC可以改善缺血/再灌注誘導的心肌損傷。另外，損傷引起的胞膜通透性增加，大量Na+內流，通過Na+-Ca2+交換，胞內Ca2+明顯上升，使細胞Ca2+超載，加重細胞損傷，而血清Ca2+則明顯下降[6]。本研究結果表明，擠壓傷后血清Ca2+較對照組顯著下降，CS+VitC-10、-20、-40組血清 Ca2+的含量明顯升高，說明VitC可以緩解缺血/再灌注損傷引起的心肌損傷。

CK在肌細胞中含量豐富，而CK-MB以心肌細胞含量多[7]，cTnI為心肌肌鈣蛋白的組成成分之一，只在心肌中表達，具有高度的組織特異性。研究表明，心肌細胞損傷后，cTnI釋放入血，使血清濃度增加，血清cTnI升高的幅度與心肌損傷的程度具有明顯的一致性，可作為心肌損傷的特異指標[8]。本研究結果顯示，擠壓傷后6 h大鼠血清CK-MB與cTnI升高，提示在擠壓傷的早期就可能有心肌損傷的存在；而CS+VitC-10、-20、-40組血清 CK-MB與cTnI的含量明顯降低，說明VitC可以緩解缺血/再灌注損傷引起的心肌損傷，導致生存率從28%(CS組)提高到64.0%(VitC-20組)和72.0%(VitC-40組)。

為了探討VitC緩解肢體擠壓傷后心肌繼發損傷的可能機制，本研究檢測了血漿ANP和ET-1濃度的變化。ANP是近年來發現的血管活性物質，由心房肌細胞合成和分泌，具有血管舒張、外周阻力減少、腎排水排鈉增多等生理作用[9]。ANP也可存在于血漿和腦脊髓液中，血漿中的ANP來源于心臟心肌分泌[10]。本研究結果顯示，擠壓傷后血漿與心肌組織中ANF的水平較對照組均降低，而靜脈注射VitC后ET-1的水平均顯著升高。

ET-1主要由血管內皮細胞合成和分泌，具有強烈的縮血管作用；在生理狀態下，ET-1能夠維持正常的血管張力和心肌收縮力，對心臟具有正性變力和正性變時效應。ET-1在慢性心力衰竭、高血壓、腎臟疾病的發生中具有重要作用[11]。故心肌及血漿內ET-1的水平是心肌損傷的一個重要活性物質，可以作為臨床判定心肌損傷損害程度的指標[12]。本研究結果顯示，擠壓傷后血漿與心肌組織中ET-1的水平較對照組均升高，而靜脈注射VitC后ET-1的水平均顯著降低，從而降低心肌損傷，并且改進CS大鼠的生存率。

綜上所述，在CS大鼠模型中靜脈給藥VitC可以明顯降低缺血/再灌注誘發心肌損傷，并且可以提高生存率。

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