肝轉移瘤血液供應來源分析

武中林,吳勇超,谷鐵樹,巨英超,王永中,李順宗*

(1.河北醫科大學第四醫院放射科,河北 石家莊 050011;

2.河北醫科大學第四醫院動物中心,河北 石家莊 050011)

·論著·

肝轉移瘤血液供應來源分析

武中林1,吳勇超1,谷鐵樹1,巨英超2,王永中1,李順宗1*

(1.河北醫科大學第四醫院放射科,河北 石家莊 050011;

2.河北醫科大學第四醫院動物中心,河北 石家莊 050011)

[摘要]目的建立兔肝轉移瘤(liver metastasis,LM)模型，通過免疫組織化學及CT灌注掃描分析兔LM的血液供應來源。方法將VX2瘤株種植于新西蘭大白兔(35只)脾臟，CT掃描確認LM形成后，行灌注掃描分析灌注參數，分離荷瘤兔LM行CD34、細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion moleculer-1,ICAM-1)、α平脊肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫組織化學染色。結果兔LM(315.76±24.78) μm時瘤內表達ICAM-1、CD34，α-SMA未見表達，瘤內陽性ICAM-1與鄰近肝竇內陽性ICAM-1相連；LM(632.58±35.46) μm時瘤內表達ICAM-1、CD34及少量α-SMA表達，瘤內陽性ICAM-1與鄰近肝竇內陽性ICAM-1相連；LM(1 056.32±124.67) μm時瘤內表達CD34、α-SMA及少量ICAM-1表達；LM(2 183.15±167.32) μm和LM(5 326.00±172.51) μm時瘤內表達CD34、α-SMA，ICAM-1染色消失或僅有少量的染色出現在瘤旁或與瘤灶相鄰的正常肝竇中；在1.0 cm以上時壞死區周圍瘤組織表達CD34、α-SMA，ICAM-1染色同前。兔LM的CT灌注掃描表現為環形強化，環形強化區的組織血流量、組織血容量、肝動脈供血分數、肝動脈灌注量、肝動脈灌注指數明顯大于瘤周正常肝組織，門靜脈灌注量、門靜脈灌注指數明顯小于瘤周正常肝組織，差異有統計學意義(P<0.01)。結論兔LM的早期階段由門靜脈供血，肝動脈不參與供血，隨著LM的增大，肝動脈供血逐漸增加，門靜脈供血逐漸減少，到LM(2 183.15±167.32)μm以上時僅為肝動脈供血，門靜脈不參與供血。

[關鍵詞]肝腫瘤；腫瘤轉移；血液

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.017

肝臟由于接受門靜脈和肝動脈的雙重血液供應，致使大家對肝轉移瘤(liver metastases,LM)血液供應產生了不同的觀點[1-5]。有研究認為LM完全由肝動脈供血，門靜脈不參與供血；另有研究認為LM不僅接受肝動脈供血，也接受門靜脈供血。這些研究結論導致有人采用肝動脈化療栓塞術一種途徑，有人采用肝動脈、門靜脈雙重途徑，有人采用肝動脈、門靜脈置泵或雙重置泵來治療LM[4-6]，這是LM血管內介入治療所面臨的最重要問題，因而明確LM的血液供應來源，對患者治療方式的選擇具有重要的指導意義。本研究建立兔LM模型，通過免疫組織化學及CT灌注掃描分析兔LM的血液供應來源。報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及瘤株新西蘭大白兔35只由河北醫科大學第四醫院實驗動物中心提供，雌雄不限，體質量2.5~3.0 kg。VX2瘤株由第四軍醫大學唐都醫院惠贈。兔多克隆抗體[CD34、細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion moleculer-1,ICAM-1)、α平脊肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)]購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2兔LM模型的建立新西蘭大白兔全身麻醉后暴露腹腔臟器，游離脾臟，將1×107細胞/mL的VX2瘤株懸液注入脾臟，還納腹腔臟器，逐層縫合，青霉素40萬U連續3 d。2周后行肝臟CT掃描，確認LM形成后行灌注掃描及免疫組織化學染色。

1.3CT灌注掃描經耳緣靜脈注入碘佛醇350，速度為1 mL/s，總量為4 mL，總掃描時間為12 s，間隔時間1 s，層厚2.5 mm。將圖像及數據用GE公司perfusion 3軟件包中的肝臟腫瘤灌注模式進行后處理，用軟件自帶測量工具測量LM的大小，后選取1.0 cm以上LM和瘤周正常肝組織的興趣區，利用軟件測量腫瘤直徑及自動計算出LM及瘤周正常肝組織的組織血流量(blood flow,BF)、組織血容量(blood volume,BV)、肝動脈供血分數(hepatic arterial fraction,HAF)，肝動脈灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)、門靜脈灌注量(portal vein perfusion,PVP)，根據公式計算出肝動脈灌注指數(hepatic arterial index，HPI)=HAP/(HAP+PVP)和門靜脈灌注指數(portal venous perfusion index,PPI)=PVP/(HAP+PVP)。

1.4LM標本采取及免疫組織化學染色將荷瘤兔處死解剖肝臟，8只荷瘤兔解剖肝臟后發現肝內多發大小不等病灶，分離轉移瘤組織(包括部分周圍正常肝組織)、固定，然后包埋成蠟塊，所有入選蠟塊連續切4 μm厚切片，按試劑盒說明書操作步驟分別行CD34、ICAM-1及α-SMA染色。鏡下觀察統計瘤體大小及微血管密度(microvessel density,MVD)值，根據MVD值進行分段，如一種抗體MVD值較前明顯變化分入下一階段。免疫組織化學陽性結果判斷為血管內皮出現棕黃色染色，彩色細胞圖像分析系統計數MVD值。

2結果

2.1建模情況建模成功33只荷瘤兔，CT灌注掃描發現LM病灶46個，直徑1.25~2.74 cm，平均(1.60±0.27) cm，33只荷瘤兔共制成蠟塊131塊。

2.2兔LM免疫組織化學染色在LM(315.76±24.78) μm時，共觀察17個蠟塊，瘤內表達ICAM-1、CD34，未表達α-SMA，瘤內陽性ICAM-1與鄰近肝竇內陽性ICAM-1相連(圖1)；在LM(632.58±35.46) μm時，共觀察21個蠟塊，瘤內表達ICAM-1、CD34，少量表達α-SMA，瘤內陽性ICAM-1與鄰近肝竇內陽性ICAM-1相連；在LM(1 056.32±124.67) μm時,共觀察37個蠟塊，瘤內表達CD34、α-SMA，少量表達ICAM-1；在LM(2 183.15±167.32) μm和(5 326.00±172.51) μm時，分別觀察35個及12個蠟塊，瘤內表達CD34、α-SMA，ICAM-1染色消失或僅有少量的染色出現在瘤旁或與瘤灶相鄰的正常肝竇中(圖2)；LM在1.0 cm以上時，共觀察9個蠟塊，壞死區周圍瘤組織表達CD34、α-SMA，ICAM-1染色同前。免疫組織化學染色的MVD值見表1。

2.3兔LM的CT灌注LM的灌注掃描表現為環形強化，環形強化區的BF、BV、HAF、HAP、HPI明顯大于瘤周正常肝組織，環形強化區的PVP、PPI明顯小于瘤周正常肝組織，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。CT灌注掃描偽彩圖見圖3。

表1　不同大小兔LM的CD34、ICAM-1、α-SMA的MVD值Table 1　MVD value of CD34,ICAM-1 and α-SMA in different LM size

表2　46個LM病灶及瘤周正常肝組織CT灌注掃描的灌注參數Table 2　CT perfusion changes between 46 LM lesions and peritumoral normal liver meastases

3討論

腫瘤的發生發展是一復雜的生物學過程，實體腫瘤的生長需要新生血管形成以獲取血液供應，目前國內外學者公認的評價腫瘤血管生成的“金標準”是腫瘤新生血管的MVD，多數研究采用CD31、CD34、α-SMA等標記物檢測MVD[7-10]。近年來隨著CT灌注成像技術的不斷成熟和發展，為判斷腫瘤血管情況提供了一種新方法[11-12]。由于CT所能顯示的LM直徑多在1.0 cm以上，且CT灌注成像技術的興趣區選擇對于直徑在1.0 cm以下的LM也較困難，故本研究對1.0 cm以下兔LM采用免疫組織化學法分析，對1.0 cm以上兔LM采用CT灌注成像技術法分析。

Liu等[3]在大鼠LM瘤模型中采用抗CD34抗體(評價瘤內新生血管)、抗α-SMA抗體(評價瘤內動脈新生血管)、抗ICAM-1抗體(評價瘤內及瘤周正常肝竇內門靜脈)免疫組織化學法及活體免疫熒光顯微鏡研究LM血液供應情況，結果顯示，LM在最初階段門靜脈及肝動脈均無供血，早期階段由門靜脈供血，隨著LM的增長由肝動脈及門靜脈雙重供血，隨著轉移瘤進一步的增長最后完全由肝動脈供血，而門靜脈不再參與供血。本研究結果顯示，在兔LM(315.76±24.78) μm大小時，瘤內ICAM-1的MVD值21.24±2.12明顯高于CD34的MVD值9.35±1.54，瘤內陽性ICAM-1與鄰近肝竇內陽性ICAM-1相連，說明門靜脈進入瘤體內，參與了LM血液供應；瘤內未見α-SMA表達，說明肝動脈無供血；CD34僅在瘤內表達說明腫瘤為維持繼續生長開始生成新生血管，此時LM由門靜脈供血，而無肝動脈供血。在兔LM(632.58±35.46) μm大小時，瘤內ICAM-1的MVD值10.54±1.36較前21.24±2.12明顯下降，說明隨著LM的增大，門靜脈供血開始減少，CD34的MVD值25.75±5.85較前9.35±1.54明顯增高，瘤內開始出現α-SMA陽性表達，說明隨著LM的增大，瘤內新生血管逐漸變得規則，新生血管逐漸變得趨向于正常的動脈血管，肝動脈開始向LM供血。在兔LM(1 056.32±124.67) μm大小時，瘤內ICAM-1的MVD值5.68±1.17較前10.54±1.57進一步下降，而CD34、α-SMA的MVD值43.74±2.39、10.63±3.47較前25.75±5.85、3.36±2.25明顯增高，說明隨著LM的增大，門靜脈供血逐漸減少，肝動脈供血逐漸增加，此時LM接受門靜脈及肝動脈雙重供血。在兔LM(2 183.15±167.32) μm大小時，瘤內CD34的MVD值47.29±3.57較前43.74±2.39稍有增高，α-SMA的MVD值17.58±3.82較前10.63±3.47明顯增高，ICAM-1染色消失或僅有少量的染色出現在瘤旁或與瘤灶相鄰的正常肝竇中，說明隨著LM的進一步增大，由于腫瘤營養需求的增加，瘤內動脈新生血管明顯增多，LM由動脈新生血管汲取營養，此時LM由肝動脈供血，門靜脈不參與供血。在LM(5 326±172.51) μm大小時，瘤內CD34、α-SMA的MVD值較前稍有增高，ICAM-1染色消失或僅有少量的染色出現在瘤旁或與瘤灶相鄰的正常肝竇中，說明隨著LM的增大，LM仍然由肝動脈供血，門靜脈不參與供血。本研究結果與Liu等[3]研究結論相似，但由于技術及設備原因，本研究未能觀察到LM最初階段即肝動脈及門靜脈均不參與供血階段，我們將在下一步實驗中完善此階段研究。

Miles等[13]認為組織學上MVD的增加及所致的動脈血管化導致了LM內的HAP的升高，因此HAP可以反映腫瘤血管形成的微細解剖學變化。本研究結果顯示，CT灌注掃描共發現LM病灶46個，直徑1.25~2.74cm，灌注掃描表現為環形強化，環形強化區的BF、BV、HAF、HAP、HPI明顯大于瘤周正常肝組織(P<0.01)，說明肝動脈參與了LM的血液供應；環形強化區的PVP、PPI明顯小于瘤周正常肝組織(P<0.01)，說明門靜脈不參與供血。如果門靜脈不參與LM供血，理論上環形強化區的PVP、PPI值應該為零，但我們忽略這樣一個事實，LM只要有肝動脈供血，在門靜脈期掃描也會出現增強，也就是說在門靜脈期掃描時，肝動脈內的對比劑仍然是存在的，本研究PVP、PPI值均大于零可能由此造成。本研究下一步將采用腸系膜上動脈插管行單純門靜脈CT灌注成像，排除肝動脈供血的干擾，進一步明確門靜脈不參與LM血液供應。直徑1.0 cm以上LM免疫組織化學分析顯示，瘤內可見不同程度的壞死，并且壞死隨LM的增大而增加，壞死區周圍的瘤組織表達CD34、α-SMA，ICAM-1染色消失或僅有少量的染色出現在瘤旁或與瘤灶相鄰的正常肝竇中，說明隨著LM的進一步增大，壞死區周圍的瘤組織仍然由肝動脈供血，門靜脈不參與供血；CD34、α-SMA的MVD值較前稍減低，說明隨著LM的增大，腫瘤新生血管無明顯增加，由于瘤體中心代謝旺盛，血液供應相對不足，又缺乏彌散供養的條件，導致腫瘤中心出現壞死，這也就解釋了為什么LM灌注掃描表現為環形強化。王守安等[14]研究顯示，富血液供應和乏血液供應型LM的強化方式及灌注結果差異有統計學意義，但全肝總灌注量、PVP、PPI均減低，HPI均增加。因此，可以推測無論是富血液供應轉移瘤，還是乏血液供應轉移瘤，其供血血管主要是肝動脈，而不是門靜脈，只不過血液供應程度不一樣。

肝臟是惡性腫瘤最常見的轉移器官之一，肝動脈化療栓塞是目前國內外公認對失去手術機會LM的首選治療方法[15-16]，肝動脈化療栓塞治療LM的理論基礎是LM由肝動脈供血，而正常肝組織由門靜脈供血，這為肝動脈化療栓塞治療LM提供了安全和療效上的保證。(本文圖見封二)

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2015-01-21；[修回日期]2015-01-30

[基金項目]河北省醫學科學研究重點課題(20110139；20120356)

[作者簡介]武中林(1979-)，男，河北承德人，河北醫科大學第四醫院主治醫師，醫學博士，從事腫瘤介入治療研究。 *通訊作者。E-mail:lishunzong2005@163.com

[中圖分類號]R735.7

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)04-0428-05

Analysis on blood supply of metastasis liver neoplasm
WU Zhong-lin1,WU Yong-chao1,GU Tie-shu1,JU Ying-chao2,

WANG Yong-zhong1,LI Shun-zong1*

(1.Department of Radiology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011,China；

2.Animal Center，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the blood supply of rabbit liver metastasis(LM) based on its model by using CT perfusion and immunohistochemical method.MethodsVX2 tumor strains were injected in the spleen of 35 New Zealand white rabbits.The LM was confirmed by using CT scan,and then the CT perfusion was performed.The rabbit LM was separated.The immunohistochemical staining was used to observe the expressions of CD34，intercellular cell adhesion moleculer-1(ICAM-1) and α-smooth muscle actin(α-SMA).ResultsWhen the average size of LM neoplasm reached approximately to(315.76±24.78) μm,no expressions of ICAM-1,CD34 and α-SMA could be observed,and the ICAM-1 positive cells in the tumor were connected with the normal sinusoidal.CD34 and ICAM-1 positive cells and some α-SMA positive cells could be seen in the size of LM(632.58±35.46) μm neoplasm,and the ICAM-1 positive cells in the tumor were connected with the normal sinusoidal.The CD34 and α-SMA positively expressed in the size of LM(1 056.32±124.67) μm neoplasm,and the ICAM-1 positive cells were further reduced; only CD34 and α-SMA positive cells expressed in the average size of LM(2 183.15±167.32) and LM(5 326.00±172.51) μm neoplasms,ICAM-1 staining disappeared or only a few ICAM-1 positive cells could be found around the sinusoidal tumor or normal sinusoidal; the size of 1.0 cm metastases expressed the CD34，α-SMA and ICAM-1,and the staining was similar to the previous stage.LM showed ring staining.CT perfusion of LM of hepatic arterial fraction，hepatic arterial perfusion，hepatic arterial index were greater than the perlesion liver tissue,while portal vein perfusion and portal venous perfusion index were less than the perlesion liver tissue.ConclusionThe early stage of rabbit LM was supplied by portal vein blood,with the increase of LM,the hepatic artery increased gradually,the portal vein blood supply decreased gradually.When LM developed to a certain stage,only the hepatic artery,portal vein does not participate in the blood supply.

[Key words]liver neoplasms；neoplasm metastasis；blood