腦脊液細胞計數與實時熒光定量PCR檢測結核菌在結核性腦膜炎診斷中的相關性分析

呂翠環，李玉靜，鄭立恒，劉俊平，杜月菊，馬玉騰

(1.河北省胸科醫院檢驗科，河北 石家莊 050041；

2.河北省胸科醫院呼吸科，河北 石家莊 050041；

3.河北醫科大學第二醫院急診重癥醫學科,河北 石家莊 050000)

·論著·

腦脊液細胞計數與實時熒光定量PCR檢測結核菌在結核性腦膜炎診斷中的相關性分析

呂翠環1，李玉靜1，鄭立恒1，劉俊平2，杜月菊1，馬玉騰3

(1.河北省胸科醫院檢驗科，河北 石家莊 050041；

2.河北省胸科醫院呼吸科，河北 石家莊 050041；

3.河北醫科大學第二醫院急診重癥醫學科,河北 石家莊 050000)

[摘要]目的分析結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)腦脊液細胞數變化,探討其與腦脊液中結核分枝桿菌實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)檢測陽性的相關性。方法選取確診的結核性腦膜炎患者81例，應用全自動血液-體液細胞分析儀進行腦脊液細胞總數計數、離心甩片作腦脊液細胞涂片,光學顯微鏡圖像分析系統分類計數，應用FQ-PCR法檢測腦脊液中結核分枝桿菌,兩者進行相關性分析。結果FQ-PCR法檢測TB-DNA陽性率為50.6%(41/81)，其中FQ-PCR陽性組中白細胞總數高于陰性組(P<0.05)。且白細胞數與FQ-PCR拷貝數呈正相關。FQ-PCR陽性中腦脊液細胞學表現：以混合型細胞反應為主，其中淋巴細胞比例0.590，中性粒細胞比例0.366。結論結核性腦膜炎腦脊液細胞學大多以淋巴細胞反應為主，腦脊液白細胞數的變化可以反映疾病的嚴重程度，與FQ-PCR聯合檢測對早期診斷結核性腦膜炎有一定的意義。

[關鍵詞]結核,腦膜；白細胞增多；實時聚合酶鏈反應

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.019

結核性腦膜炎是結核病中最嚴重的類型，其臨床表現復雜、多樣，病情進展迅速，致死率、致殘率高。其死亡與延遲診斷和治療密切相關，所以迫切需要早期快速診斷。目前對結核性腦膜炎的診斷及輔助診斷方法眾多，以腦脊液結核菌涂片鏡檢最為廣泛，為了提高患者的存活率，如何選擇快速方法，克服傳統細菌學的局限性是關鍵。本研究對81例結核性腦膜炎患者的腦脊液標本進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)及細胞學結果的回顧性分析，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料2012年12月—2014年5月在河北省胸科醫院臨床確診為結核性腦膜炎患者81例，男性47例，女性34例，年齡14~68歲,平均(32.1±12.3)歲。所有患者均出現不同程度的發熱、頭痛、嘔吐癥狀，腦膜刺激征陽性，其中28例為血性播散性肺結核。

1.2診斷標準所有對象經過臨床診斷、實驗室診斷、影像學診斷、臨床治療評價等，根據中華醫學會編著的《臨床診療指南結核病學分冊》標準[1]確診。

1.3檢測方法

1.3.1腦脊液常規檢查①收集常規腰椎穿刺腦脊液1.0~1.5 mL，先觀察顏色、透明度，應用Sysmex XT-4000i分析儀測白細胞總數；②取剩余腦脊液于Thermo Cytospin 4離心機進行離心甩片5 min，取出玻片晾干后行瑞姬染色，應用光學顯微鏡圖像分析系統分類計數。

1.3.2FQ-PCR檢測收取無菌留取的腦脊液1 mL進行腦脊液TB-DNA檢測，儀器設備為達安基因有限公司生產的7600型實時熒光定量檢測系統，試劑盒為中山大學達安基因有限公司生產的結核分枝桿菌核酸擴增熒光試劑盒。嚴格按照試劑說明書操作，每次操作均加入質控品。

2結果

2.1FQ-PCR結果所有標本中均選第1次腦脊液測定TB-DNA>50 copy為陽性。81例患者中FQ-PCR方法檢測TB-DNA陽性者41例，均值為13.94×102，陰性者40例，均值為31.25。

2.2腦脊液常規結果81例標本中均選第1次腦脊液測定白細胞總數>8×106/L為陽性；其中TB-DNA陽性組中白細胞總數(1~600)×106/L，平均(202.87±174.6)×106/L，陰性組中白細胞總數(2~521)×106/L，平均(130.25±145.6)×106/L，兩組間差異有統計學意義(t=2.053,P<0.05),見圖1。

腦脊液細胞學分類主要是以混合細胞反應為主，其中淋巴細胞0.590，中性粒細胞0.366。

圖1　FQ-PCR陽性組與陰性組白細胞總數比較Figure 1　Comparison of leukocyte number between PCR positive group and PCR negative group

2.3腦脊液FQ-PCR陽性與其對應白細胞總數相關性分析腦脊液FQ-PCR陽性數值與其對應的白細胞總數呈正相關(r=0.937，P<0.01)，見圖2。

圖2　腦脊液FQ-PCR陽性與白細胞總數的關系Figure 2　Correlation between FQ-PCR positive cerebrospinal fluid and leukocyte number

3討論

結核性腦膜炎是結核分枝桿菌引起的以腦膜為主的非化膿性炎癥,是最嚴重的肺外結核病,由于其不易從腦脊液涂片中找到結核桿菌,細菌培養和動物接種的周期較長，加之臨床表現沒有特異性，使得其早期診斷變得非常困難，但是結核性腦膜炎的早期診斷和治療可以挽救患者生命和降低其神經功能的損傷，所以要求找到敏感和特異的快速診斷結核性腦膜炎的方法，結核性腦膜炎患者的早期臨床診斷一直是臨床工作中的一項難題。

應用細胞學動態觀察對結核性腦膜炎進行早期診斷是目前臨床診斷中操作簡單實用的一種方法。本研究選取81例結核性腦膜炎患者檢測腦脊液細胞發現患者早期反應主要是以混合細胞反應為主，其中淋巴細胞0.590，中性粒細胞0.366，結果證明結核性腦膜炎細胞學有2種類型，不僅具有結核性腦膜炎早期滲出常見的混合細胞型反應類型[2]，同時還有少量結核性腦膜炎呈淋巴樣細胞反應類型。這與閆世明等[3]的研究一致。本研究中結核性腦膜炎患者腦脊液白細胞總數最高為600×106/L，Kawakami等[4]也報道結核性腦膜炎腦脊液中白細胞數高達870×106/L，且大多為中性粒細胞。

PCR在醫學檢驗學中最有價值的應用領域就是對感染性疾病的診斷，理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。PCR成為一種潛在的理想的檢測結核性腦膜炎的工具[5]。一般實驗室能檢出10~100基因拷貝，而目前病原體抗原檢測方法一般需要105~7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態。定量PCR研究資料已表明，病原體數量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有關系[6]。FQ-PCR方法檢測TB-DNA可進行準確的定量檢測，特異度更高，操作簡單快速。二者方法各有特點。有報道基因探針方法檢測結核性腦膜炎TB-DNA敏感度33%~83%，特異度100%[7],而FQ-PCR法檢測腦脊液結核桿菌具有更高的敏感度與特異度[8-9]。本研究結果顯示，81例確診結核性腦膜炎標本中41例TB-DNA結果陽性基本與報道相符。根據PCR檢測原理，結核菌數量與PCR的拷貝值呈正相關，但是很少文獻研究PCR陽性與白細胞的相關性。本研究中TB-DNA陽性組中白細胞總數(1~600)×106/L，平均(202.87±174.6)×106/L，陰性組中白細胞總數(2~521)×106/L，平均(130.25±145.6)×106/L，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，二者呈正相關性，說明腦脊液中白細胞數與疾病的嚴重程度有關，這為今后臨床早期診斷檢測提供了依據。PCR是臨床可靠的早期診斷結核性腦膜炎的方法之一[10],腦脊液TB-DNA陰性說明結核菌含量相對少量、感染程度較輕,也可能是因為臨床用藥使腦脊液中結核菌受到控制。本研究結果顯示，FQ-PCR陽性的細胞數與FQ-PCR陰性的細胞數差異有統計學意義，說明結核性腦膜炎患者體內結核菌數量越多引起的機體免疫、應激反應越強烈[11]，最終以白細胞增多的形式表現出來。

綜上所述，結核性腦膜炎腦脊液FQ-PCR陽性的細胞數顯著高于FQ-PCR陰性的細胞數，且FQ-PCR陽性值與腦脊液細胞數呈正相關，細胞類型多為淋巴細胞為主的混合細胞反應。腦脊液細胞檢測的敏感度與FQ-PCR檢測的特異度相結合勢必會為臨床結核性腦膜炎的早期診斷帶來希望，這需要我們進一步的探索和研究。

[參考文獻]

[1]中華醫學會.臨床診療指南結核病學分冊[M].北京:人民衛生出版社，2009:58-61.

[2]徐仿成,王興中,陳先文.腦脊液中嗜中性粒細胞對中樞神經系統感染的診斷價值[J].安徽醫學,2009,30(2):112-114.

[3]閆世明,秦桂香,趙云虹,等.結核性腦膜炎腦脊液細胞學的臨床研究[J].中國防癆雜志,2011,33(12):780-784.

[4]Kawakami S,Kawamura Y,Nishiyama K，et al.Case of Mycobacterium tuberculosis meningitis:gram staining as a useful initial diagnostic clue for tuberculous meningitis[J].J Infect Chemother,2012,18(6):931-936.

[5]崔會娟,何俊瑛.腦脊液檢測診斷結核性腦膜炎[J].河北醫科大學學報,2006,27(5):498-500.

[6]高斌,劉敬忠.實時熒光定量PCR技術的研究及其應用進展[J].診斷學理論與實踐，2005,4(6):507-509.

[7]Lang AM,Feris-Iglesias J,Pena C,et al.Clinical evaluation of the gen-probe amplified direct test for detection of Mycobacterium tuberculosis complex organisms in cerebrospinal fluid[J].J Clin Microbiol,1998,36(8): 2191-2194.

[8]Chaidir L,Ganiem AR,Vander Zanden A，et al.Comparison of real time IS6110-PCR,microscopy,and culture for diagnosis of tuberculous meningitis in a cohort of adult patients in Indonesia[J].PLoS One,2012,7(12):e52001.

[9]李銳成,劉昕陽,閻琳,等.實時熒光定量聚合酶鏈反應技術在結核性腦膜炎中的診斷價值[J].臨床薈萃,2014,29(1):31-34.

[10]Nagdev KJ,Kashyap RS,Deshpande PS,et al.Comparative evaluation of a PCR assay with an in-house ELISA method for diagnosis of tuberculous meningitis[J].Med Sci Monit,2010,16(6):289-295.

[11]張敏，常曉琳，楊毅寧，等.結核性腦膜腦炎腦脊液細胞學動態分析及其診斷價值[J].中華神經外科疾病研究雜志,2009,8(3)：239-242.

(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-10-15；[修回日期]2014-12-09

[基金項目]河北省科學技術研究與發展計劃項目(13277794D)；

[作者簡介]呂翠環(1966-)，女，河北石家莊人，河北省胸科醫院主任技師，醫學學士，從事臨床檢驗學研究。

[中圖分類號]R529.3

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)04-0433-04

Correlation analysis between cell count of cerebrospinal fluid and real time PCR detection in diagnosis of cerebral tuberculosis

LV Cui-huan1，LI Yu-jing1，ZHENG Li-heng1，LIU Jun-ping2，DU Yue-ju1，MA Yu-teng3

(1.Clinical Laboratory,the Chest Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050041,China;2.Department of

Respiratory Medicine,the Chest Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050041,China;3.Intensive

Care Unit,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze the cell count of cerebrospinal fluid in tuberculous meningitis(TBM) and explore the association of test positive for Mycobacterium tuberculosis by real time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR) and cell count.MethodsThe study selected 81 patients with tuberculous meningitis.Cerebrospinal fluid cell was counted by automatic blood-body fluid cytoanalyzer,cell smears of cerebrospinal fluid were made by centrifugal machine and cells were classified by image analysis system of optical microscope.Mycobacterium tuberculosis in cerebrospinal fluid was detected by FQ-PCR and its correlation with cell count was analyzed.ResultsThe positive rate of M.tuberculosis DNA(TB-DNA) by FQ-PCR method was 50.6%(41/81).The leukocyte count of FQ-PCR positive group was higher than that of the negative group(P<0.05).The leukocyte number was positively correlated with the copy number of FQ-PCR.The characteristics of cerebrospinal fluid cytology in FQ-PCR positive group indicated that the mixed cellular reaction was dominant，and the lymphocytes ratio was 0.590,while neutrophils ratio was 0.366.ConclusionThe cerebrospinal fluid cytology of tuberculous meningitis is mostly lymphocyte reaction,cerebrospinal fluid leukocyte count in combination with PCR can reflect the severity of disease and has certain significance for the early diagnosis of tuberculous meningitis.

[Key words]tuberculosis,meningeal；leukocytosis；real-time polymerase chain reaction

河北省科學技術研究與發展指導計劃項目(132777269)