丹紅對百草枯中毒大鼠肺TGF-β1的影響

韋紅梅,胡利明,郝志強，吳明霞

(1.河北省安國市醫(yī)院呼吸科，河北 安國 071200；

2.河北省滄州市渤海新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 滄州 061113)

·論著·

丹紅對百草枯中毒大鼠肺TGF-β1的影響

韋紅梅1,胡利明1,郝志強1，吳明霞2

(1.河北省安國市醫(yī)院呼吸科，河北 安國 071200；

2.河北省滄州市渤海新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 滄州 061113)

[摘要]目的觀察丹紅注射液對百草枯中毒大鼠肺中轉(zhuǎn)化生化因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達的影響，并探討其肺臟保護機制。方法百草枯灌胃染毒造模,觀察肺指數(shù)、肺組織病理學變化及形態(tài)改變,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定大鼠血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，采用免疫組織化學方法測定肺組織中 TGF-β1的表達。結(jié)果單純?nèi)径窘M和丹紅治療組各時間點血清中TNF-α水平和肺組織中TGF-β1水平均高于空白對照組，丹紅治療組血清中TNF-α水平和肺組織中TGF-β1水平低于單純?nèi)径窘M，單純?nèi)径窘M隨時間延長TNF-α和TGF-β1水平逐漸增高，丹紅治療組隨時間延長TNF-α和TGF-β1水平逐漸降低，組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論丹紅注射液能通過抑制TGF-β1的合成、降低血清中TNF-α水平，減少細胞外基質(zhì)異常積聚，對百草枯中毒大鼠肺臟具有保護作用。

[關鍵詞]百草枯；中毒；丹紅；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.021

丹紅注射液是丹參和紅花提取物的中藥制劑。有抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、改善微循環(huán)、降血脂、抗動脈粥樣硬化、耐缺氧、保護血管內(nèi)皮、抗細胞凋亡等作用。百草枯是應用比較廣泛的一種除草劑，對人畜均有較強的毒性，能造成機體多臟器的損傷。百草枯損害的主要器官是肺，因其死亡的主要原因是肺損傷引起的呼吸性衰竭。本研究以百草枯灌胃染毒造模,觀察丹紅注射液對百草枯染毒所致大鼠肺病理改變及演變的影響，探討丹紅注射液對肺臟器官的保護作用機制。報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物分組選擇健康清潔的成年SD大鼠(雄性) 72只(購于河北省實驗動物中心)，體質(zhì)量200~240 g，隨機分為空白對照組8只、單純?nèi)径窘M32只、丹紅治療組32只。

1.1.1空白對照組生理鹽水1 mL一次性灌胃。

1.1.2單純?nèi)径窘M百草枯按50 mg/kg用生理鹽水稀釋至1 mL，用其一次性灌胃染毒，染毒后馬上給予生理鹽水(劑量與丹紅注射液量相同，1 mL/kg)腹腔內(nèi)注射，每天注射1次，直至死亡。

1.1.3丹紅治療組百草枯灌胃染毒(與單純?nèi)径?組量相同)，染毒后馬上給予丹紅注射液1 mL/kg (約0.2 mL) 腹腔注射，每天注射1次，直至死亡。

1.2灌胃染毒百草枯按照50 mg/kg進行計算，用生理鹽水將20%百草枯稀釋至1 mL(新鮮配制)，進行一次性灌胃染毒，操作過程: 用16號長穿刺針外套管，頂端焊成球形，制成灌胃針，用其連接已抽取百草枯溶液注射器，左手抓牢大鼠，用拇指、食指固定下顎，使其頭、頸在一條線上，取垂直位，右手持針，進針深度6~8 cm，若其沒有明顯的掙扎即可進行注射藥物，實驗期間，各組大鼠自由進食、喝水。

1.3標本收集及制備單純?nèi)径尽⒌ぜt治療組分別于1、7、14、21 d,各取 8 只大鼠，氯胺酮麻醉后，經(jīng)股靜脈取血，高速離心后，留取血清備用；用在200 ℃下烤過的器械進行開胸，快速取出部分左肺組織，用刀片將其分成1 mm×1 mm×1 mm大小4~6 塊，置于盛有4% 中性甲醛的小瓶中浸泡固定12 h，制備石蠟切片。對照組8只做同樣處理。

1.4檢測指標及方法

1.4.1酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平測定應用雙抗體夾心ABC-ELISA法。ELISA試劑盒預先包被單克隆抗體，需要檢測的抗體為純化多克隆抗體，將用生物素標記的樣品和抗體以及用氧化物酶標記的親和素，先后加入酶標板孔，反應后，用PBS洗滌，底物3,4,5-三甲氧基苯甲醛(3,4,5-Trimethoxybenzaldehyde，TMB)顯色。用酶標儀450 nm測定(光密度,optical density，OD)值，用標準品和樣品吸光值減去對照孔吸光值所得數(shù)據(jù)在坐標上畫出曲線，并根據(jù)樣品吸光值于坐標上找出對應的濃度。

1.4.2肺組織形態(tài)學改變石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察肺組織病變程度。

1.4.3免疫組織化學檢測法將載玻片用APES防脫片處理，然后用石蠟切片進行脫蠟入水，再用3%甲醛-雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性(Ⅰ型膠原標本組用1 %胰酶室溫消化45 min)。然后用10%山羊血清進行封閉，室溫下放置30 min，以封閉非特異性的結(jié)合位點。加入一抗兔抗鼠Ⅰ型膠原(稀釋度為1∶50)；兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(稀釋度為1∶50)，4 ℃下孵育過夜。陰性對照組則使用PBS來代替一抗。加入生物素標記的羊抗兔二抗工作液。加入三抗用辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37 ℃下孵育30 min。以二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min(顯微鏡下控制顯色的時間)后，終止顯色。使用蘇木精復染1 min，后用1%鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。圖像分析及結(jié)果判定：用免疫組織化學染色的TGF-β1可見在細胞漿內(nèi)表達。顯微鏡下可以觀察到棕黃色為陽性。用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)來計算結(jié)果。

2結(jié)果

2.13組血清中TNF-α水平比較單純?nèi)径窘M血清中各時點血清中TNF-α水平均高于空白對照組，且隨著時間的延長，單純?nèi)径窘MTNF-α水平逐漸升高；丹紅治療組血清中各時點TNF-α水平均低于單純?nèi)径窘M，且隨著時間的延長，丹紅治療組TNF-α水平逐漸降低，但仍高于空白對照組。3組在組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　3組血清中TNF-α水平比較

2.2肺組織形態(tài)學改變空白對照組肺泡結(jié)構(gòu)比較清晰而且肺泡壁相對較完整，未出現(xiàn)明顯肺泡壁充血及增厚，肺泡腔內(nèi)亦未見炎性細胞浸潤。單純?nèi)径窘M1 d時出現(xiàn)明顯的急性肺泡炎癥，如形成部分透明膜、肺水腫、彌漫性肺出血以及炎性細胞的浸潤等;7 d 時仍主要為肺泡炎性改變; 14 、28 d 時出現(xiàn)不同程度的肺泡間質(zhì)纖維性增厚、纖維組織增生，可見玻璃樣變。丹紅治療組也出現(xiàn)單純?nèi)径窘M的表現(xiàn)，但程度較單純?nèi)径窘M輕。

2.33組肺組織中TGF-β1水平比較單純?nèi)径窘M血清中各時點肺組織中TGF-β1水平均高于空白對照組，且隨著時間的延長，單純?nèi)径窘MTGF-β1水平逐漸升高；丹紅治療組肺組織中各時點TGF-β1水平均低于單純?nèi)径窘M，且隨著時間的延長，丹紅治療組TGF-β1水平逐漸降低，但仍高于空白對照組。3組在組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　3組血清中TGF-β1水平比較

3討論

肺是百草枯中毒后損傷的主要靶器官,可引起不可逆的進行性肺纖維化，最終導致患者呼吸衰竭死亡。百草枯中毒所致的肺損傷表現(xiàn)為早期肺泡上皮細胞受損,肺泡內(nèi)出血水腫,炎癥細胞浸潤,晚期可出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化,這種表現(xiàn)被命名為 “百草枯肺”[1]。肺纖維化是百草枯中毒導致患者呼吸衰竭死亡的主要原因。百草枯中毒引起肺間質(zhì)纖維化的形成機制極其復雜，其中TGF-β1是肺間質(zhì)纖維化形成的關鍵因子[2]。研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液輔助治療百草枯中毒肺纖維化有較好的療效[3]。丹參的化學成分[4]為脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類,后者包括丹參素、原兒茶醛和丹參酸。紅花黃色素是從紅花中提取出的有效成分，具有使冠狀動脈擴張、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、降血脂以及耐缺氧等作用，從而被廣泛應用于心腦血管病的治療[5-8]。

百草枯灌胃染毒是誘導大鼠肺發(fā)生纖維化可靠方法之一，博萊霉素經(jīng)氣管內(nèi)注入法廣泛地用于制作大鼠實驗性肺纖維化模型[9]，研究發(fā)現(xiàn)，在給予百草枯灌胃后，大鼠出現(xiàn)張口呼吸、呼吸頻率加快、氣促、呼吸困難等改變，經(jīng)肉眼觀察可發(fā)現(xiàn)肺臟的體積出現(xiàn)變化，顏色變得不均勻，先是輕度充血，后充血加重，充血減輕，繼而變得蒼白，開始出現(xiàn)瘀血，或者粉紅色相間等改變，最后出現(xiàn)纖維瘢痕灶，逐漸加重[10]。實驗表明，百草枯灌胃染毒是目前制造肺纖維化動物模型可靠的方法，而且灌胃染毒比腹腔內(nèi)注射染毒能更好地模擬百草枯臨床中毒的特點[11-12]，值得在百草枯中毒相關研究中進行推廣。

TNF-α既是參與機體的免疫防護的重要介質(zhì)，又可以參與機體的免疫病理損傷。正常水平的TNF-α可以調(diào)節(jié)免疫應答、抗感染、促進組織修復、引起腫瘤細胞凋亡等。研究[13]發(fā)現(xiàn),在大鼠肺成纖維細胞中 TNF-α能使TGF-β1表達上調(diào),主要是TNF-α可以活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 ( extracellular signal-regulated kinase,ERK),而 ERK的抑制劑則可以抑制 TGF-β1mRNA和蛋白的產(chǎn)生。

百草枯中毒后，肺部癥狀主要表現(xiàn)為可誘導肺上皮HPAEpiC細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進發(fā)生肺間質(zhì)纖維化[14]。TGF-β1具有促進氣道平滑肌細胞增殖的作用，能夠促使成纖維細胞產(chǎn)生膠原和氨基多糖，誘導使成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，進而促使肺纖維化的形成。因此，在氣道結(jié)構(gòu)的變化中，TGF-β1又是一種致纖維化因子，導致肺纖維化改變，加重肺功能的進行性損害。

本研究結(jié)果顯示，單純?nèi)径窘M肺臟組織中TGF-β1表達逐漸增加，丹紅治療組TGF-β1蛋白的表達水平較單純?nèi)径窘M明顯降低，證實丹紅注射液可以影響百草枯中毒大鼠肺組織中 TGF-β1的表達，使TGF-β1的表達減少。提示丹紅注射液具有抗纖維化作用，其抗肺纖維化作用可能與肺組織中TGF-β1表達有關。

綜上所述，丹紅注射液能通過抑制TGF-β1的合成、降低血清中TNF-α水平，減少細胞外基質(zhì)異常積聚，對百草枯中毒大鼠肺臟具有保護作用。

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-11-26；[修回日期]2014-12-14

[作者簡介]韋紅梅(1978-)，女，河北定興人，河北省安國市醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學學士，從事呼吸內(nèi)科疾病診治研究。

[中圖分類號]R595.9

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2015)04-0441-04