谷氨酰胺轉胺酶基因的結構分析及定點突變

（中南民族大學生命科學學院，湖北武漢430074）

谷氨酰胺轉胺酶（transglutaminase，TG），即蛋白質－谷氨酸－γ－谷氨酰胺基轉移酶（EC2.3.2.13），可以催化蛋白質和氨基酸之間交聯、蛋白分子內谷氨酰胺基的水解以及蛋白分子內及分子間的連接，可以改善食品結構、提高食品彈性、保持食品營養。TG 可從植物、動物、微生物中獲得［1－2］，其中微生物來源的谷氨酰胺轉胺酶（MTG）是TG 獲取的主要渠道。酶修飾法反應條件溫和、副作用少、作用快捷安全，廣泛應用于食品改造［3］。因此，MTG 作為一種新型的食品添加劑，在改造及生產新型蛋白食品方面具有良好的發展前景［4］。

蛋白質三維結構模型的確定和分析在酶促反應、突變分析、蛋白質復合物和酶活位點的界面相互作用分析等方面有著重要的作用。但蛋白質序列數據庫中多肽記錄的數量與結構數據庫中結構記錄的數量都很少，需要發展計算機預測方法來預測蛋白質的三維結構。目前，三維結構的主要預測方法有：比較建模（comparative modeling，CM）、穿線（threading）及自由建模（free modeling）。其中比較建模法是最為成功的方法，它是利用相似性的已知結構來預測未知序列的三維結構，而常用的就是利用網絡直接搜索PDB數據庫和SWISS－MODEL服務器。

作者在此根據分離得到的吸水鏈霉菌的MTG 基因，預測其三維結構，確定其酶活中心，并構建定點突變體。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體

吸水鏈霉菌（Streptomycessp.）H197菌株、質粒pET－22b（＋）、E.coliBL21（DE3），中南民族大學生命科學學院生物工程實驗室；pMD19－T，TaKaRa公司。

1.1.2 培養基

LB液體培養基：NaCl 1%，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，pH 值7.0。

高氏一號固體培養基：可溶性淀粉2%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.05%，KNO30.1%，K2HPO40.05%，瓊脂2.5%，pH 值7.2～7.4。

發酵培養基：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，酵母膏0.5%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，CaCO30.5%，pH 值7.0。

1.1.3 試劑

BamHⅠ、HindⅢ、Amp＋、Ex－Taq 酶、pfu酶，TaKaRa 公司；凝膠回收試劑盒，Axygen 公司；DL2000DNA marker、λHindⅢ，BBI公司；其它試劑均為國產分析純。

1.1.4 引物

引物由上海生工生物工程有限公司合成，測序由擎科生物公司完成。擴增引物f1（正向）、f2（反向）及加酶切位點的擴增引物F1（正向）、F2（反向）由DNAMAN5.0設計，突變引物R1（正向）、R2（反向）為PrimerX 在線設計，R1和R2是兩條互補的引物，在互補區域內引入突變位點。

f1：5′－ATCCATGTACAAACGCCGGAGATT－3′f2：5′－CTTACGGCCAGCCCTGCTT－3′

F1：5′－CGAGGATCCATGTACAAACGCCGGAGATT－3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點）

F2：5′－CGCAAGCTTACGGCCAGCCCTGCTT－3′（下劃線為HindⅢ酶切位點）

R1：5′－CAAAACCATATGGACCAAA·GCCAACCACTATCACG－3′（“·”標記為突變位點）

R2：5′－CGTGATAGTGGTTGGCTTTGGTCCATATGGTTTTG－3′（“·”標記為突變位點）

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的獲得

將實驗室－70 ℃保藏的吸水鏈霉菌H197 在高氏一號固體培養基上30 ℃培養3～4d；挑取單菌落，接種到5 mL LB 液體培養基中，于30 ℃、200r·min－1培養3～5d；再挑取單菌落，接種到20mL發酵培養基上進行擴大培養，于30℃、200r·min－1培養4～5d［5］；采用優化的SDS方法［6］提取鏈霉菌總DNA，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定檢測；以其為模板，以f1、f2為引物，擴增MTG 基因。

反應體系（25μL）：10×PCR buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTP（10mmol·L－1）2μL，f1、f2（10mmol·L－1）各1.0μL，Ex－Taq酶（2.5U·μL－1）0.5μL，總DNA 1.0μL，ddH2O 17μL。

反應條件：預變性94 ℃5min；94 ℃40s，58 ℃60s，72℃40s，30個循環；72℃延伸10min，10℃保溫20min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大孔徑切膠回收，連接pMD19－T 載體進行測序。

1.2.2 目的基因片段的序列比對及分析

將測序后的序列（完整的ORF）在NCBI上進行序列比對。通過文獻找到這個蛋白的活性位點（Cys64－Asp255－His274）［7］；通過序列比對，找到目的蛋白的可能的酶活位點Cys151－Asp342－His361。利用ExPASy對序列進行MTG 編碼蛋白的理化性質分析，并在線預測MTG 的信號肽序列、糖基化位點。

1.2.3 目的蛋白的三維結構預測

通過SWISS－MODEL獲取PDB格式的蛋白三維結構［8－10］，根據數據庫比對結果，在構建的三維結構中找到可能活性位點。并根據氨基酸的性質，確定突變其中一個位點，研究其對酶活性的影響。

1.2.4 定點突變

采用重疊延伸PCR（SOE－PCR）技術進行定點突變，其原理與過程見圖1。

圖1 SOE－PCR原理與過程Fig.1 Principle and process of SOE－PCR

1）以構建的pMD19－T－MTG 質粒作為模板，以F1、R2、F2、R1為引物，分別擴增出上下游片段A、B。

反應體系：10×PCR buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTP（10 mmol·L－1）2μL，F1、R2（F2、R1）（10 mmol·L－1）各1.0μL，pfu酶（2.5 U·μL－1）0.5 μL，總DNA 1.0μL，ddH2O 17μL。

反應條件：預變性94 ℃5min；94 ℃40s，60 ℃40s，72℃40s，25個循環；72℃延伸10min，10℃保溫20min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后分別大孔徑切膠回收，－20 ℃保存。

2）將所得2份PCR 產物互為模板及引物，進行第二次PCR 擴增。

反應體系：F1、F2（10mmol·L－1）各1.0μL，上游目的片段A 1.0 μL，下游目的片段B 1.0 μL，ddH2O 16μL，其它同第一次PCR。

反應條件：同第一次PCR。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大孔徑切膠回收，－20 ℃保存。

1.2.5 突變工程菌的構建

pET－22b（＋）質粒及PCR 產物的雙酶切：分別在37 ℃下用酶切體系處理pET－22b（＋）質粒及PCR 產物6h，取3μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大孔徑切膠回收，－20 ℃保存。

酶切體系：10×K buffer 5.0μL，BamHⅠ1.0 μL，HindⅢ1.0μL，ddH2O 8.0μL，pET－22b（＋）質粒35μL（PCR 產物35μL），37 ℃，6h。

重組質粒的連接：將雙酶切后的PCR 產物8.0 μL、線性化pET－22b（＋）質粒5.0μL、10×T4buffer 1.5μL、ddH2O 0.5μL、T4DNA ligase 1.0μL 16 ℃過夜，采用CaCl2法將連接產物轉化到感受態細胞E.coliBL21（DE3）中，采用藍白斑法，挑取陽性菌落進行菌落PCR 驗證，陽性轉化子測序。

2 結果與討論

2.1 目的基因片段的檢測結果

吸水鏈霉菌H197總DNA 和MTG 基因擴增產物的電泳圖譜見圖2。

由圖2a可以看到，在23kbp處有特異性片段，初步確定DNA 提取成功。由圖2b可以看到，MTG 基因擴增產物出現1 200bp左右的目的基因片段。

2.2 目的基因片段的序列比對及檢測結果

在NCBI中進行protein blast，跟一株已知結構的茂原鏈輪絲菌進行比對，根據茂原鏈輪絲菌基因的結構，找到可能酶活位點Cys151－Asp342－His361（圖3中的方框）。圖中陰影部分為MTG 的α螺旋和β折疊區域。

圖2 吸水鏈霉菌H197總DNA（a）和MTG 基因擴增產物（b）的電泳圖譜Fig.2 Electrophorogram of Streptomyces sp.H197genomic DNA（a）and PCR product of gene MTG（b）

圖3 目的基因片段序列比對Fig.3 Alignment of objective gene fragment sequence

經ExPASy服務器在線分析MTG 的氨基酸組成，結果如表2所示。

MTG 蛋白共418 個氨基酸長度，預期大小為46 635.95Da，PI點為7.08，GC 含量為61.26%，通過http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP－2.0／在線預測蛋白質信號肽，發現MTG 信號肽含有29個氨基酸。通過http：／／www.cbs.dtu.dk／service／NetOGlyc／預測MTG 蛋白O－糖基化修飾位點時發現，該序列含有蘇氨酸糖基化位點，但其G 值低于可被糖基化的最小閾值，所以不被糖基化。通過http：／／www.cbs.dtu.dk／service／NetNGlyc－1.0／檢測也未發現N－糖基化位點。表明表達的蛋白大小不會改變。

表2 吸水鏈霉菌H197中MTG 的氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of MTG from Streptomyces sp.H197

2.3 目的蛋白的三維結構預測（圖4）

圖4 MTG 三維結構預測Fig.4 Three－dimensional structure prediction of MTG

通過SWISS－MODEL構建的三維結構模型分析，MTG 分子主要由α螺旋區（灰色）和β折疊區（黑色）構成，α螺旋區相對分布在分子的外部，而β折疊區相對分布在分子內部，其中兩個活性位點都在β折疊區。預測的活性中心在分子內部相對靠攏，形成一個內陷的空間。

2.4 定點突變

以構建的pMD19－T－MTG 質粒為模板，以F1、R2、F2、R1為引物，分別擴增出上下游目的片段A、B，其中上游目的片段A 大小為1 117bp，下游目的片段B大小為186bp，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在相應大小的位置檢測到了特異性片段（圖5a、b）。經重疊延伸后，在1 200bp左右的位置找到了單一的目的條帶（圖5c），與預期目的片段大小相當，初步確定已獲得目的突變片段。

圖5 目的片段A（a）、B（b）和SOE－PCR產物（c）的電泳圖譜Fig.5 Electrophorogram of objective fragment A（a），objective fragment B（b）and SOE－PCR product（c）

2.5 突變工程菌的構建

將pET－22b（＋）質粒和突變后的PCR 基因產物采用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切，回收酶切后的產物，將連接后重組質粒pET－22b（＋）－MTG 采用CaCl2法轉化感受態細胞E.coliBL21（DE3），使用藍白斑篩選，提取陽性轉化子進行單、雙酶切驗證，經1%瓊脂糖凝膠檢測，在相應位置檢測到預期大小的目的片段（圖6）。

將突變型基因測序結果與野生型基因序列對比，在1 090位和1 092位的C均變成了A（圖7），與預期結果相同。表明已成功應用SOE－PCR 技術進行了突變，且突變工程菌pET－22b（＋）－MTG 已成功構建。

圖6 單酶切及雙酶切電泳圖譜Fig.6 Electrophorogram of single enzyme digestion and double enzyme digestion

圖7 突變基因序列與野生型基因序列比對Fig.7 Alignment of mutant gene sequence and wild gene sequence

2.6 討論

定點突變可以便捷地改造優化基因，是研究基因與蛋白質結構與功能的重要手段之一。陳熙等［11］利用定點突變技術將人溶菌酶進行定點突變并在真核表達系統中進行體外表達，得到較野生型更高活力的突變體。郝大利等［12］定點突變大腸桿菌aroG基因，并與trpBA基因串聯表達，獲得了高產色氨酸菌株。

SOE－PCR技術自1989年由Horton等構建以來已成為主要的定點突變技術［13］。孫萬菊等［14］利用SOE－PCR 技術成功突變幽門螺桿菌熱休克蛋白60基因，在原核表達載體中獲得了高效表達的可溶性hsp60蛋白。在使用SOE－PCR 技術的時候應注意DNA 聚合酶的質量，應避免使用普通的Taq酶，而應使用高保真Taq酶，因為普通Taq酶會在PCR 產物的3′末端加上一個A，從而造成移碼突變，本實驗采用的pfu高保真酶避免了此問題的發生。SOE－PCR 技術因原理簡單、操作方便、適用性廣而被廣泛用于基因克隆的研究。本實驗成功地通過SOE－PCR 技術實現了定點突變，構建了突變體。

3 結論

通過預測谷氨酰胺轉胺酶基因的三維結構，同源比對確定其可能的酶活中心，利用SOE－PCR 技術定點突變其中一個活性位點，并構建了突變工程菌，為后續研究其活性位點的功能奠定了基礎。

［1］FALCONE P，SERAFINI－FACASSINI D，DUCA S D.Comparative studies of transglutaminase activity and substrates in different organs ofHelianthustuberosus［J］.Plant Physiol，1993，142（3）：265－273.

［2］ANDO H，ADACHI M，UMEDA K，et al.Purification and characterisrics of a novel transgluatminase derived from microorganisms［J］.Agriculture Biological Chemistry，1989，53：2163－2617.

［3］ZHU Y，RINZEMA A，TRAMPER J，et al.Microbial transglu－taminase－A review of its production and application in food processing［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1995，44（3－4）：277－282.

［4］常中義，江波.微生物谷氨酰胺轉胺酶的應用進展［J］.食品科學，2002，21（9）：6－8.

［5］何冬蘭，張瑩，彭寶玉.重組谷氨酰胺轉胺酶基因的原核表達研究［J］.中南民族大學學報（自然科學版），2010，29（4）：32－36.

［6］劉炳輝，曹遠銀，閆建芳，等.6種鏈霉菌基因組DNA 提取方法比較［J］.河南農業科學，2008，（10）：86－89.

［7］KASHIWAGI T，YOKOYAMA K，ISHIKAWA K，et al.Crystal structure of Microbial transglutaminase fromStreptoverticillium mobaraense［J］.J Biol Chem，2002，277（46）：44252－44260.

［8］ARNOLD K，BORDOLI L，KOPP J，et al.The SWISS－MODEL workspace：A web－based environment for protein structure homology modeling［J］.Bioinformatics，2006，22（2）：195－201.

［9］SCHWEDE T，KOPP J，GUEX N，et al.SWISS－MODEL：An automated protein homology－modeling server［J］.Nucleic Acids Research，2003，31（13）：3381－3385.

［10］GUEX N，PEITSCH M C.SWISS－MODEL and the Swiss－Pdb－Viewer：An environment for comparative protein modeling［J］.Electrophoresis，1997，18（15）：2714－2723.

［11］陳熙，陳毓，齊小雨，等.人溶菌酶定點突變基因在畢赤酵母中的表達及活性分析［J］.江蘇農業學報，2014，30（6）：1396－1401.

［12］郝大利，諸葛斌，方慧英，等.大腸桿菌aroG基因的定點突變及與trpBA基因的串聯表達［J］.應用與環境生物學報，2013，19（5）：817－821.

［13］WARRENS A N，JONES M D，LECHLER R I.Splicing by overlap extension by PCR using asymmetric amplification：An improved technique for the generation of hybrid proteins of immunological interest［J］.Gene，1997，186（1）：29－35.

［14］孫萬菊，杜東龍，蔣宏，等.幽門螺桿菌熱休克蛋白60基因的定點突變及其原核表達［J］.中國病原生物學雜志，2013，8（8）：695－697.