南極海泥來源抗腫瘤真菌的篩選與鑒定

（中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇南京210009）

海洋微生物由于資源豐富，在解決用藥需求問題的同時具有不破壞生態環境等優點，其生物活性物質的研究已成為國內外研究的熱點［1］。特別是海洋真菌因其代謝途徑復雜、代謝產物種類繁多而日益受到研究者的重視［2］，是開發抗腫瘤及其它藥物的重要資源。海洋真菌次級代謝產物因新穎的骨架結構而具有生物活性的多樣性［3］，其抗氧化性、抗菌、抗酪氨酸酶、細胞毒活性或抗腫瘤、醌還原酶誘導和抗瘧原蟲活性也被廣泛研究［4］。目前，已從海洋環境中分離得到多種具有較強細胞毒活性和抗腫瘤活性的天然產物，僅2006～2012年間，就從海洋真菌中分離得到了690個天然產物［4］，其中大多數化合物屬于聚酮類，其次為生物堿、萜類以及肽類。這些海洋真菌多屬于青霉屬和曲霉屬，還有不常見的頂頭胞屬、裸胞殼菌屬、附球菌屬等。雖然從海洋真菌中分離的抗癌先導化合物進入人體臨床試驗的數量大幅增加［5］，但這些先導化合物由于結構復雜、合成難度較大，難以滿足臨床需求［6］。

作者在此對61株分離自南極海泥的海洋真菌進行抗腫瘤活性篩選，以期發現具有潛在應用前景的抗腫瘤活性菌株，并為活性物質的分離奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

海泥樣品取自南極深海，保存于中國藥科大學微生物制藥實驗室。

MTT（噻唑藍），Sigma公司；1640培養基、胎牛血清，Giboco公司；二甲基亞砜、乙酸乙酯，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；真菌基因組DNA 提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；Taq酶，上海生物工程公司；PCR 引物由上海生物工程公司合成。

SHZ－D（Ⅲ）型循環水式真空泵、HH－S型水浴鍋，鞏義予華儀器有限責任公司；BS1245型分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限責任公司；DHG－9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海恒科有限公司；CO2培養箱，Excella公司；酶標儀，BIO－TEK 公司；旋轉真空蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SW－CJ－2FD 型超凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；凝膠成像系統，Bio－Rad公司。

1.2 培養基

分離培養基：馬鈴薯培養基（取200g馬鈴薯，煮沸30min，5～8層紗布過濾，濾液補足至1 000mL）中加入葡萄糖1.6%、瓊脂2%、海鹽1.6%，混合后加入200mg氯霉素。

發酵培養基：葡萄糖3%，可溶性淀粉2%，酵母粉1%，KH2PO42%，海鹽2%，MgSO4·7H2O 0.6%。

細胞培養基：1640培養基中加入10%的胎牛血清和1%的雙抗。

1.3 腫瘤細胞株

人肝癌HepG－2細胞；人胃癌7901細胞；人結腸癌116細胞。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離

采用平板稀釋法，取海泥樣品1g，加無菌水10 mL，激烈振蕩制備混懸液，逐步稀釋制成10－1～10－7梯度溶液，分別涂布于分離平板上，28 ℃倒置培養。觀察菌落的形態，挑取形態大小差異較大的菌落，純化后4 ℃冰箱保存。

1.4.2 乙酸乙酯萃取物的制備

將純化后的菌體由斜面接種至發酵培養基中，于28 ℃、200r·min－1培養7d，發酵液去除菌絲體，用等體積乙酸乙酯萃取3次，上層有機相于45℃減壓濃縮至干，用二甲基亞砜溶解配制成100μg·mL－1的粗品并用0.22μm 微孔濾膜過濾供活性測試。

1.4.3 抗腫瘤活性菌株的篩選

采用MTT 法［7］測試乙酸乙酯萃取物的體外抗腫瘤活性。取對數生長期的細胞，用細胞消化液消化并收集細胞，吹打混勻，記數，配制成5×104個·mL－1的細胞懸液。按每孔180μL 接種于96孔板，并設置陰性對照和空白對照。于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24h后加入20μL稀釋的乙酸乙酯萃取物，每個濃度設置5 個復孔，繼續培養20h。每孔加入20μL MTT，反應4h后取出，吸去上清液，加入150μL 二甲基亞砜溶液，用酶標儀測定590nm 處吸光度，按下式計算抑制率。

1.4.4 活性菌株的鑒定

取適量發酵液，離心，去上清液，將菌絲體在液氮中充分研磨后轉入2 mL EP 管中，用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA 后，采用真菌通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）擴增提取的rDNA ITS基因。PCR 反應體系為50μL：模板DNA 5μL、引物ITS1和引物ITS4各1μL、dNTP mixture（2.5mmol·L－1）4μL、10×PCR buffer 5μL、Taq酶5μL；ddH2O 33.5μL。PCR 反應條件為：94 ℃預變性3min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，33個循環；72 ℃延伸3min。

PCR 擴增產物的檢測：取5μL 擴增產物加1μL 6×上樣緩沖溶液，于含溴化乙啶的1% 瓊脂糖凝膠上100V 電泳30min，在紫外燈下觀察純化結果。對純化后產物測序，并與GenBank中已知序列進行比對，以鑒定抗腫瘤活性菌株的歸屬。

2 結果與討論

2.1 抗腫瘤活性菌株的初篩

采用MTT 法對分離得到的61株海洋真菌進行活性初篩。分別測定100 μg·mL－1海洋真菌對HepG－2細胞、7901細胞及116細胞的抑制率，結果見表1。

由表1可知：有27株菌對HepG－2細胞抑制率大于60%，占總供試菌株的44.26%；有22株菌對7901細胞具有抑制作用，占總供試菌株的36.07%；有22株菌對116 細胞抑制率大于50%，占總供試菌株的36.07%。

2.2 抗腫瘤活性菌株的復篩

為進一步驗證活性菌株的抗腫瘤活性，采用倍比稀釋法將初篩中具有較高抗腫瘤活性的9株菌株濃度（μg·mL－1）分別稀釋為50、25、12.5、6.25，通過MTT 法測定其在不同濃度下對HepG－2細胞的抑制率，并計算IC50值，結果見表2。

由表2可知，菌株S33、S45發酵液的濃度稀釋到6.25μg·mL－1時，抗腫瘤活性仍然很高。于是，又將其濃度（μg·mL－1）稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625，結果發現菌株S33和S45仍具有很高的抗腫瘤活性，其IC50值分別為3.53μg·mL－1和1.25μg·mL－1。

2.3 抗腫瘤活性菌株的鑒定

對具有較高抗腫瘤活性的菌株S3、S26、S33、S45、S48、S50、S58進行測序，并與GenBank中已知序列進行比對，結果見表3。

由表3 可知，菌株S3 屬黑附球菌屬，菌株S26、S50屬曲霉屬，菌株S33、S45屬青霉屬，菌株S48屬藍狀菌屬，菌株S58屬交鏈孢真菌屬。

3 結論

從南極海泥樣品中分離得到61株海洋真菌，先采用MTT 法對其發酵液的乙酸乙酯萃取物進行體外抗腫瘤活性篩選，然后對活性較高的菌株進行鑒定，并進一步測定乙酸乙酯萃取物對HepG－2細胞的IC50值。結果表明：對HepG－2細胞抑制率大于60%的有29株菌，占總供試菌株的47.54%；對7901 細胞具有抑制作用的有22 株菌，占總供試菌株的36.07%；對116細胞抑制率大于50%的有22株菌，占總供試菌株的36.07%；菌株S45的抗腫瘤活性最強，對HepG－2細胞的IC50值為1.25μg·mL－1，經鑒定為青霉屬真菌。

表1 抗腫瘤活性菌株對HepG－2細胞、7901細胞及116細胞的抑制率／%Tab.1 Inhibition rate of antitumor active strains against cell HepG－2，cell 7901and cell 116／%

表2 抗腫瘤活性菌株對HepG－2細胞的抑制率及IC50值Tab.2 Inhibition rate and IC50value of antitumor active strains against cell HepG－2

表3 抗腫瘤活性菌株的鑒定Tab.3 Identification of antitumor active strains

［1］張亞鵬，朱偉明，顧謙群，等.源于海洋真菌抗腫瘤活性物質的研究進展［J］.中國海洋藥物，2006，25（1）：54－58.

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［4］DUARTE K，ROCHA－SANTOS T A P，FREITAS A C，et al.Analytical techniques for discovery of bioactive compounds from marine fungi［J］.Trends in Analytical Chemistry，2012，34：97－110.

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