曾園山：將脊髓損傷修復研究進行到底

本刊記者 孫秋霞 徐芳芳

曾園山：將脊髓損傷修復研究進行到底

本刊記者 孫秋霞 徐芳芳

曾園山教授在辦公室

隨著我國交通事業(yè)和建筑事業(yè)的高速發(fā)展，交通事故和建筑事故等引起的創(chuàng)傷性脊髓疾病越來越嚴重危害人民的生命健康。其中，急性嚴重的脊髓損傷會導致患者截癱或四肢癱。這種致殘性損傷給患者和家庭帶來極大的痛苦和巨大的經(jīng)濟負擔。在相當長的時間里，國內(nèi)外沒有行之有效的治療方法。

不過，這一現(xiàn)狀可能會得到改觀。中山大學中山醫(yī)學院組織胚胎學系教授曾園山正在帶領他的團隊，致力于干細胞移植與脊髓損傷修復機制的研究。曾園山透露，他們正在尋找修復脊髓損傷的新策略，弄清其修復機制，并試圖應用于臨床前研究，這必將對創(chuàng)傷性脊髓疾病的有效治療提供強有力的保證。

開創(chuàng)脊髓損傷修復新方法

梅，素有國花之譽，世人皆傾慕之，以其為州名，遂有“梅州”。始建于秦朝的廣東省梅州市，是曾園山的故鄉(xiāng)，這里景色怡人，人文薈萃，先后培育出兩院院士22名。曾園山是中山大學組織胚胎學系主任、博士生導師，從普通家庭學子到大學教授，曾園山身上始終有著一股不服輸?shù)膭艃?，不怕吃苦的精神?/p>

在組織學與胚胎學領域工作和學習了將近37年的曾園山，發(fā)表學術論文150篇，其中48篇發(fā)表在SCI收錄的英文期刊上。相繼獲得“嗎啡促進脊髓可塑性變化的研究”國家衛(wèi)生部科技進步三等獎、“人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構(gòu)建方法”和“一種用于修復神經(jīng)損傷的明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建”兩項國家發(fā)明專利，使我國在應用組織工程技術修復創(chuàng)傷性脊髓病傷研究領域居于國際前列。

從事多年的干細胞移植與脊髓損傷修復的研究，曾園山有兩個較為滿意的研究成果。

2008年，曾園山和他的研究生所發(fā)明的“人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構(gòu)建方法”獲得國家發(fā)明專利。曾園山告訴記者，應用神經(jīng)營養(yǎng)因子治療脊髓損傷是目前研究的熱點之一，所使用的多是神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5(NT-4/5)等。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是能夠支持機體神經(jīng)元存活，促進其生長、分化，及維持其功能的一類化學因子。它包括NT-3、NGF、BDNF和NT-4/5等。神經(jīng)營養(yǎng)因子對其靶細胞起生物學作用之前，首先要與靶細胞上的受體結(jié)合。目前已知神經(jīng)營養(yǎng)因子有兩種受體：酪氨酸蛋白激酶受體(高親和力受體)和p75受體(低親和力受體)。酪氨酸蛋白激酶受體是由原癌基因Trk編碼的一種受體, 亦稱為Trk受體。Trk受體又可分為TrkA、TrkB和TrkC 3種。神經(jīng)營養(yǎng)因子與其受體的結(jié)合是有選擇性的。NGF與受體TrkA結(jié)合，BDNF和NT-4/5與受體TrkB結(jié)合，NT-3與受體TrkC結(jié)合?，F(xiàn)有研究表明，NT-3能促使表達TrkC的神經(jīng)干細胞更多地分化為神經(jīng)元。

曾園山解釋道，他們將TrkC基因轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細胞后移植到脊髓損傷處，讓神經(jīng)干細胞過表達NT-3受體，同時一起移植NT-3基因修飾的雪旺細胞，讓轉(zhuǎn)基因雪旺細胞過表達NT-3，更好地促進帶有NT-3受體的神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元，生長出軸突。此方法能在脊髓損傷處形成神經(jīng)元網(wǎng)絡，起上、下行傳導神經(jīng)信息的橋梁作用，修復脊髓自主運動功能。這種治療策略，可能會更有效地促進受損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的修復，為臨床治療脊髓創(chuàng)傷性疾病乃至大腦創(chuàng)傷性疾病提供新方法。

曾園山滿意的第二項成果，是用于修復脊髓損傷的三維明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建，該項研究成果于2011年獲得國家發(fā)明專利授權(quán)。

在脊髓創(chuàng)傷中，生物組織工程材料作為移植細胞或作為具有保護神經(jīng)元和促進其軸突再生作用的活性因子的載體，逐漸引起人們的關注。

組織工程材料分為天然來源生物材料、不可降解合成材料和可降解高分子合成材料。天然生物材料做成的凝膠、明膠海綿和膠原海綿，或者用可降解高分子合成材料做成的導管，都可用于橫斷性脊髓損傷修復。凝膠能夠在脊髓損傷空洞處起填充作用，促進軸突再生，減少星形膠質(zhì)細胞增生形成的疤痕。但是，它不能較好地介導再生軸突穿越損傷區(qū)域，并且缺乏機械強度。導管最大的優(yōu)勢是，它有一定的機械強度，能夠介導再生軸突穿越導管本身，達到橫斷傷脊髓組織的另一端，即起到橋接作用，但有些導管在降解之后產(chǎn)生的酸性物質(zhì)對鄰近細胞有損害作用。

鑒于以上認識，曾園山團隊設立了發(fā)明的基本方案?！拔覀円远嗫紫睹髂z海綿為主體，外面應用PLGA薄膜包裹，形成一種形貌像圓柱體的支架材料。在此基礎上吸附骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞或雪旺細胞等，構(gòu)建成能夠促進軸突再生的可降解天然生物材料支架。應用時，將其移植到橫斷性脊髓損傷處或神經(jīng)損傷處。”此項發(fā)明為他團隊日后應用組織工程技術修復創(chuàng)傷性脊髓病傷奠定了強有力的基礎，現(xiàn)已制備成功干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡支架，正在研制的類脊髓樣組織支架等。

在2013年中國組織胚胎學學術研討會上介紹醫(yī)學本科《組織學與胚胎學》實驗教學綜合改革思路與實施

醫(yī)學教育

“不管從哪里來，都要一步步往上走，哪怕再辛苦也不怕”。曾園山不僅告誡自己，也這樣教育自己的學生。在科研與教學中，曾園山總是傾力以赴。他認為，一個好的大學老師，不僅要傳授專業(yè)知識，還應該探索自己感興趣的知識，從而豐富和挑戰(zhàn)專業(yè)知識。

曾園山從事醫(yī)學教育工作34年了，現(xiàn)在的他，是中山醫(yī)學院組織胚胎學系主任、中國解剖學會常務理事和廣東省解剖學會理事長，廣東省重點學科（人體解剖與組織胚胎學）的帶頭人，廣東省組織學與胚胎學精品課程和廣東省組織學與胚胎學資源共享課負責人。

在醫(yī)學教育改革中，他遵循“讓學生邁好堅實的第一步”的宗旨，著重抓好學生“三基（基礎理論、基礎知識、基礎技能）”的培養(yǎng)。在精品課程建設中，他有“三個堅持”：堅持集體備課、聽課和教評制度；堅持對青年教師的教學能力培養(yǎng)；堅持在教師指導下的自學方式。

在曾園山看來，組織學與胚胎學課程是一年級醫(yī)學生的醫(yī)學前期基礎課程，為許多后續(xù)的基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學課程奠定堅實的基礎。在教學改革中，曾園山根據(jù)該學科的特點、課程性質(zhì)、授課老師的英語水平、學生的英語及專業(yè)知識基礎，循序漸進地拓展雙語教學改革，增強醫(yī)學生利用英語理解、掌握專業(yè)知識的能力及運用醫(yī)學專業(yè)英語進行學術交流、解決問題的能力。為此，他于2004年申報了中山大學教學改革專項研究課題“推進組織學與胚胎學雙語教學培養(yǎng)高素質(zhì)醫(yī)學人才”，并獲得批準立項。2008年，該項雙語教學研究成果獲中山大學優(yōu)秀教學成果獎一等獎。2012年9月，曾園山被廣東省教育廳等評選為廣東省南粵優(yōu)秀教師。2014年11月，寶鋼教育基金會授予曾園山寶鋼“優(yōu)秀”教師稱號。

曾園山非常重視人才培養(yǎng)的工作?！叭绻е鴮W生是為我來工作的態(tài)度，就會遇到很多矛盾，應該讓他們學到自己感興趣的東西。”他認為，作為老師，應該愛護和理解學生，而不是一定要學生按自己的要求行事，他始終秉持著讓學生勞有所獲的態(tài)度。曾園山常常和學生在一起交流討論，很少與學生發(fā)生矛盾。“如果確實不能夠處理好我們之間的矛盾，亦應該和氣地分開。我們還是很好的師生，很好的朋友，只是工作方式或?qū)W習方式不一樣?！痹鴪@山說：“有的同學到了他們感興趣的其他實驗室，后來發(fā)現(xiàn)還是我處理矛盾的技巧有特色。因為我們經(jīng)常跟美國、香港和新加坡有研究合作，學生能夠在其中學到知識。”至今為止，他培養(yǎng)和指導了博士生23名、碩士生29名、8年制醫(yī)學本科生4名、博士后4名和國內(nèi)訪問學者1名。

曾園山教授在實驗室

從校醫(yī)到學者

曾園山出生于廣州，他學習勤奮努力，一直讀到高中。那時還未恢復高考，靠推薦才能上大學。曾園山一步一個腳印，從許多同齡人中脫穎而出，逐漸實現(xiàn)了自己的目標。

將要高中畢業(yè)那年，曾園山被學校推薦到廣州市第一人民醫(yī)院衛(wèi)生學校進行短期培訓。一年后，他被分配到當?shù)刂袑W擔任校醫(yī)工作，需要跟著師生一起到農(nóng)村分校學農(nóng)。農(nóng)村有許多中草藥，當?shù)氐某嗄_醫(yī)生時常帶他上山采藥，并給他講解這些植物的藥用功效。那時，曾園山便對中草藥治療常見疾病充滿了好奇。

在從事醫(yī)療實踐的過程中，曾園山發(fā)現(xiàn)對一些疾病自己沒辦法去治療。那時，便產(chǎn)生了求學的熱情。由于工作表現(xiàn)出色，兩年后，他被廣州市主管中學校醫(yī)工作的部門推薦到廣州醫(yī)學院攻讀醫(yī)療系?！澳悄?，100多所中學校醫(yī)只有兩個名額。雖然我比較瘦小，但因平時工作比較賣力，肯動腦子改善師生在農(nóng)村分校的食住、學習和工作的衛(wèi)生環(huán)境，給領導和同事們留下了好的印象。”

大學期間，曾園山牢記著明確的學習目標，成績一直十分優(yōu)異。老師們曾讓他在開門辦學的課堂上講過兩次課，“由于我有一線的工作經(jīng)驗，在講課的時候就會生動一些”。畢業(yè)后，他被學校留下當了組織學與胚胎學專業(yè)老師，那時他才22歲。

“在大學教書的時候，還是覺得自己的知識不足，那時候，中山醫(yī)學院已經(jīng)開始招收研究生，但與他從事的相關專業(yè)只招一個?！苯?jīng)過幾番考慮，曾園山下定決心要考上研究生。

1980年，曾園山成為中山醫(yī)學院組織胚胎學教研室“文革”后的第一位研究生，師從郭畹華教授，研究神經(jīng)生長因子對體外培養(yǎng)神經(jīng)元突起生長機制的影響。那時，他是班里年紀較小的一個，大家選舉他做生活委員，為班上同學們服務。碩士研究生畢業(yè)后，在中山醫(yī)科大學當講師的曾園山仍不滿足現(xiàn)有的知識儲備，于是他考上華西醫(yī)科大學(現(xiàn)四川大學)攻讀博士研究生，師從吳良芳教授，研究嗎啡對脊髓可塑性的影響。1998年，他的“嗎啡促進脊髓可塑性變化的研究”獲國家衛(wèi)生部科技進步獎三等獎。

1999年，鞠躬院士負責國家重點基礎研究項目（973）“脊髓損傷修復的研究”?！爱斘覀兊弥@個消息后，立刻趕到西安第四軍醫(yī)大學鞠躬院士的辦公室，希望能夠一起來參與這個研究課題。最終我們得到了這個機會，心里非常高興?！彪m然經(jīng)過幾年探索，曾園山團隊的研究進展并不盡如人意?！爱斘覀兣c中國脊髓損傷網(wǎng)機構(gòu)的國內(nèi)、外專家交流時，發(fā)現(xiàn)僅僅移植細胞解決不了脊髓損傷修復的關鍵問題。如果我們能從其他角度來研究，也許會有另一番天地。”基于以上認識，曾園山帶領研究團隊繼續(xù)摸索?！昂髞砦覀儼l(fā)現(xiàn)，如果在體外三維支架材料里面形成干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡去移植，可能效果比前期更好?！?/p>

“熟悉我的人說，曾園山是老樹發(fā)新芽，我覺得形容得非常貼切。”曾園山總結(jié)道，前期的工作都是為后來奠下基礎，盡管前期工作看似毫無結(jié)果，但不到最后誰也不知道答案。

團隊合影

壯心不已

60歲的曾園山計劃在5年后退休?！爸猩酱髮W規(guī)定博士生導師可以工作到60歲或65歲，我覺得60歲退休有點過早。”根據(jù)國家以往的政策，曾園山如果現(xiàn)在退休，可以享受更多的福利。“即使65歲不會有這樣的福利，我也有精神上的回報，還可以在這個領域做更多的事情。”

從2014年開始，曾園山擔任國家自然科學基金重點項目“干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡支架移植修復脊髓受損傷神經(jīng)網(wǎng)絡的機制研究”的項目負責人。脊髓內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡由其中的的中間神經(jīng)元聯(lián)絡上、下行傳導信息的神經(jīng)纖維以及運動神經(jīng)元等元件構(gòu)成，脊髓損傷的結(jié)果是神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的解體，導致神經(jīng)元之間形成的環(huán)路功能喪失；同時也會導致神經(jīng)元的死亡、脊髓損傷處的神經(jīng)營養(yǎng)因子下調(diào)以及神經(jīng)生長抑制因子上調(diào)。曾園山告訴記者，嚴重的脊髓損傷不可能依靠自身再生修復，因為里面的神經(jīng)網(wǎng)絡已被破壞，需要借助人為干預幫助其結(jié)構(gòu)和功能恢復。“盡管嘗試了許多辦法來解決神經(jīng)網(wǎng)絡損傷修復的問題，但最終還是失敗了?！痹谂c同事們的討論中，曾園山亦感覺到任何單一因素的治療措施，如單純地移植細胞或是給予藥物，都不能夠有效地促使受損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的修復?！拔覀冋J為，應該利用現(xiàn)代最新的再生醫(yī)學手段來進行修復，就有可能解決脊髓損傷處的微環(huán)境不利于其自身重建神經(jīng)網(wǎng)絡這一關鍵科學問題。”

在前期研究的基礎上，他們依據(jù)脊髓主要功能是傳導上、下行神經(jīng)信息和進行反射活動的特點，綜合性運用神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體、成體干細胞和生物支架材料等再生醫(yī)學技術，在體外構(gòu)建一種具有突觸傳遞功能的神經(jīng)網(wǎng)絡支架，然后將其移植到全橫斷脊髓損傷處，在脊髓內(nèi)起到修復受損傷神經(jīng)傳導通路的中繼站作用。曾園山解釋道，這可以使原本癱瘓的肢體具有自主運動功能，加上康復訓練，為臨床治療脊髓損傷提供應用基礎研究依據(jù)。

在原來研究的基礎上，曾園山想把干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡支架變成像脊髓一樣的組織，這樣修復和替換效果可能會更好。曾園山解釋道，把體外干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡支架建成類似自然條件下的脊髓組織，這肯定沒有在自然條件下形成的脊髓組織結(jié)構(gòu)那樣精細，那樣功能完整。這項研究工作正處于初始階段，但他們已經(jīng)看到了一些曙光?！拔覀円呀?jīng)在體外構(gòu)建類脊髓樣組織看到了一些成效，將來如果在猴子身上實驗成功，就有可能嘗試用在人身上?！?/p>

最近，作為中山醫(yī)學院一方，曾園山與中山大學化工學院的全大萍教授合作，將利用3D打印技術和生物墨水，打印出脊髓組織細胞外基質(zhì)的支架材料。曾園山告訴記者，全大萍教授是做高分子材料的，如果生物墨水的配方配制得好，就能打印出豬的脊髓支架，甚至有可能打印出人的脊髓支架?！拔覀冊谥Ъ苌戏N植細胞，把它做成類脊髓樣組織，進行臨床前的研究就有了可靠的基礎”。

曾園山希望研究團隊能夠在干細胞源性神經(jīng)網(wǎng)絡、類脊髓樣組織等方面有所建樹。此外，他還希望能夠在生命科學生物組織工程領域嘗試一番，得到專家的認可。目前，一名“青年千人”愿意加盟到他的學科中，曾園山希望在退休之前好好培養(yǎng)他，讓他在3到5年能夠熟悉組織學與胚胎學課程的教學及其學科建設工作。