二氮嗪預處理對Aβ1～42作用神經元NR2B亞基蛋白表達的影響

二氮嗪預處理對Aβ1～42作用神經元NR2B亞基蛋白表達的影響

夏春鳳李艷菊朱瑾杜怡峰馬國詔張鏞

(山東大學附屬省立醫院神經內科，山東濟南250021)

摘要〔〕目的研究ATP敏感的鉀離子通道開放劑二氮嗪(diazoxide)預處理對Aβ1～42作用原代培養神經元N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體2B(NR2B)亞基蛋白表達的影響。方法原代培養大鼠皮層海馬神經元并進行鑒定，將細胞隨機分為對照組、單純Aβ1～42干預組、二氮嗪預處理1h后Aβ1～42干預組(Aβ1～42+diazoxide)、單純二氮嗪預處理組，并采用免疫印跡檢測不同時間點(24 h、72 h)細胞NR2B亞基蛋白表達水平的變化。結果Aβ1～42(2 μmol/L)作用神經元24 h后，與對照組相比，單純Aβ1～42干預組和Aβ1～42+diazoxide組的NR2B亞基蛋白表達均無明顯改變。Aβ1～42作用神經元72 h后，與對照組比較，單純Aβ1～42組NR2B亞基蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；而與單純Aβ1～42干預組相比，Aβ1～42+diazoxide組NR2B亞基蛋白表達明顯降低(P<0.05)。結論Aβ1～42作用原代培養神經元72 h，能夠顯著增加神經細胞NR2B亞基蛋白的表達量；同時，二氮嗪能拮抗Aβ1～42所引起的NR2B亞基蛋白表達量升高，提示二氮嗪可能通過NMDA受體通路影響Aβ1～42的細胞毒性作用。

關鍵詞〔〕二氮嗪；Aβ1～42；NMDA受體；NR2B亞基

中圖分類號〔〕R329.21〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30870874；30600202)

通訊作者：馬國詔(1973-)，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，主要從事研究老年性癡呆和帕金森病發病機制與防治研究。

張鏞(1962-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事老年性癡呆和腦血管疾病防治研究。

第一作者：夏春鳳(1988-)，女，碩士，主要從事老年性癡呆發病機制與防治研究。

Effects of ATP sensitive potassium channel opener diazoxide on neural NR2B subunit protein expression induced by Aβ1～42

XIA Chun-Feng, LI Yan-Ju, ZHU Jin,etal.

Department of Neurology, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, Shandong, China

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of pretreatment of ATP sensitive potassium channel opener diazoxide on neural NR2B subunit protein expression induced by Aβ1～42.MethodsThe primary neurons were cultured and evaluated, then neurons were randomly divided into control group, Aβ1～42 treatment group, diazoxide pretreatment for 1 h +Aβ1～42 group(Aβ1～42+ diazoxide) and simple diazoxide group, the protein expression level of NR2B subunit was determined by Western blotting for different times(24 h and 72 h).ResultsBeing exposed to Aβ1～42 for 24 h, compared with the control group, the protein expression level of NR2B subunit of both Aβ1～42 group and Aβ1～42+ diazoxide group have no significant difference. However, compared with control group, the protein expression level of NR2B subunit of Aβ1～42 group significantly increases for 72 h(P<0.05); Compared with Aβ1～42 group, the protein expression level of NR2B subunit of Aβ1～42+diazoxide group significantly decreases(P<0.05).ConclusionsAβ1～42 could increase the protein expression level of NR2B subunit in cultured primary neurons for 72 h, and ATP sensitive potassium channel opener diazoxide could inhibit the increasing of protein expression level of NR2B subunit induced by Aβ1-42, it is indicated that diazoxide might affect Aβ1～42-induced cytotoxicity via NMDA receptor pathway.

【Key words】Diazoxide; Aβ1～42; N-methyl-D-aspartate receptor; NR2B subunit

研究證實β-淀粉樣蛋白(Aβ)神經細胞毒性機制之一可能與N-甲基-D-天(門)冬氨酸(NMDA)受體活性密切相關〔1〕。NMDA受體是腦內重要的離子型谷氨酸受體，廣泛參與神經元的興奮性突觸傳遞、突觸可塑性以及長時程增強等許多生理及病理過程，其中NMDA受體的NR2B亞基對NMDA受體藥理和功能特性起決定作用，是一個治療與NMDA受體相關疾病的潛在靶點〔2〕。中樞神經系統的ATP敏感性鉀離子通道(KATP)激活在阿爾茨海默病(AD)中發揮重要的神經保護作用。選擇性的KATP通道開放劑二氮嗪(diazoxide)可明顯降低Aβ寡聚體聚集和Tau蛋白過磷酸化，且能改善轉基因AD鼠模型的認知功能障礙〔3〕；而且二氮嗪預處理可逆轉Aβ1～42作用神經元導致的KATP通道亞基過表達和離子流改變，抵抗Aβ1～42的神經細胞毒性，防治神經細胞凋亡〔4～6〕。但是，目前尚未見有關二氮嗪拮抗Aβ細胞毒性與NR2B亞基之間的報道。本研究旨在探討二氮嗪對Aβ1～42作用于原代培養神經元NR2B亞基蛋白表達的影響，為探索AD新的靶向藥物提供基本理論依據。

1材料與方法

1.1材料新生1 d內Wistar大乳鼠，雌雄不限，由山東大學實驗動物研究中心提供；Aβ1～42、二氮嗪、多聚賴氨酸均購自美國Sigma公司；胎牛血清、B27 supplement及Neurabasal培養基均購自美國Gibco公司；DMEM高糖培養基購自海克隆公司；兔抗大鼠NMDAR-2B一抗多克隆抗體購自英國Abcam公司；羊抗兔二抗購自中杉公司；羊抗大鼠膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和相應標記二抗均購自美國Santa Cruz公司；二甲基亞砜購自上海生博醫學生物工程科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代培養大腦皮層海馬神經元選用新生1 d的Wistar大乳鼠，75%酒精消毒，用顯微鑷子在無菌操作下分離出大腦皮層及海馬置于D-Hank液中，去腦膜，將腦組織剪成碎塊，0.125%胰酶37℃消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，吸管吹打均勻，200目不銹鋼篩網過濾，1 000 r/min離心10 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液吹打成單細胞懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的12孔板(接種密度6×105/ml)及培養皿(接種密度2×106/ml)中，37℃、5%CO2孵箱培養。第二天換含2% B27的Neurabasal培養液，每隔2 d半量換液1次，第7天加藥處理。

1.2.2皮層海馬膽堿能神經元的鑒定是突觸前的膽堿合成標志酶，利用ChAT的抗體作為膽堿能神經的標志物鑒定膽堿能神經元。神經元在爬片的第7天用ChAT免疫細胞化學染色進行鑒定，鏡下觀察膽堿能陽性神經元胞質內呈棕黃色著色。

1.2.3實驗分組及藥物處理Aβ1～42人工重組蛋白質0.1 mg，溶10 μl DMSO(DMSO濃度<1‰)中，配成濃度為221 μmol/L，100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)稀釋，即為原液。將原液置于37℃恒溫箱內孵育72 h，進行老化處理，4℃貯存備用，用時混勻。實驗分為對照組、單純Aβ1～42干預組、二氮嗪預處理1 h后Aβ1～42干預組(Aβ1～42+diazoxide組)、單純二氮嗪預處理組，各組又分為24、72 h兩個亞組。細胞培養至第7天，Aβ1～42干預組加入含Aβ1～42(2 μmol/L)的培養液；二氮嗪預處理后Aβ1～42干預組為二氮嗪(50 μmol/L)預處理1 h后加入Aβ1～42(2 μmol/L)共同作用，單純二氮嗪預處理組為二氮嗪(50 μmol/L)預處理1 h后加等量的PBS和培養液，對照組加等量的PBS和培養液，分別孵育24、72 h。

1.2.4Western印跡檢測各組NR2B亞基蛋白的表達Aβ1～42作用神經細胞24 h和72 h后，收集細胞并用PBS洗滌3次，加入適量的RIPA裂解液冰浴中裂解細胞，收集蛋白，BCA法蛋白定量，取60 μg總蛋白上樣，行8%SDS-PAGE電泳，然后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗(兔抗大鼠NR2B多克隆抗體1∶100)于4℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌3×10 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體)室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗滌3×10 min，加入發光試劑ECL顯色，以β-actin作內參照，用圖像分析軟件Band Scan進行光密度積分值分析。

2結果

2.1Western印跡檢測Aβ1～42與二氮嗪作用神經元24 h后NR2B亞基蛋白的表達單純Aβ1～42(2 μmol/L)作用神經元24 h后，NR2B亞基蛋白表達(0.66±0.04)與對照組(0.61±0.06)相比沒有明顯變化(P>0.05)；二氮嗪預處理細胞1 h后Aβ1～42共同作用24 h，NR2B亞基蛋白表達(0.58±0.04)較單純Aβ1～42干預組沒有明顯改變(P>0.05)，單純二氮嗪預處理組為(0.63±0.09)。見圖1。

2.2不同濃度Aβ1～42作用神經細胞72 h后NR2B亞基蛋白表達量改變對照組、2.5、10 μmol/L Aβ1～42組NR2B亞基蛋白表達分別為0.53±0.11，0.98±1.11；1.24±0.13，1.94±0.14。隨著Aβ1～42作用濃度的不斷增高，NR2B亞基蛋白表達量呈濃度依賴性逐漸升高(P<0.05)。見圖2。

2.3Western印跡檢測Aβ1～42與二氮嗪作用神經元72 h后NR2B亞基蛋白的表達圖3可見，單純Aβ1～42作用72 h后，NR2B亞基蛋白表達(1.05±0.08)較對照組(0.77±0.09)顯著升高(P<0.05)；Aβ1～42+diazoxide組NR2B亞基蛋白表達(0.62±0.07)與單純Aβ1～42干預組明顯降低(P<0.05)；單純二氮嗪干預組NR2B亞基蛋白表達(0.57±0.08)較對照組無明顯差異(P>0.05)。

1～4分別為對照組、單純Aβ 1～42干預組、Aβ 1～42+ diazoxide組、單純二氮嗪預處理組 圖1　免疫印跡檢測Aβ 1～42及二氮嗪處理細胞 24 h后各組NR2B亞基蛋白表達變化

圖2　不同濃度Aβ 1～42作用神經元72 h后NR2B 亞基蛋白表達量

1～4分別為對照組、單純Aβ 1～42干預組、Aβ 1～42+ diazoxide組、單純二氮嗪干預組 圖3　免疫印跡檢測Aβ 1～42及二氮嗪處理細胞72 h 后各組NR2B亞基蛋白表達變化

3討論

阿爾茨海默病(AD)是癡呆中最常見的一種類型，其臨床主要表現為進行性記憶力減退、認知功能障礙和精神行為異常。Aβ級聯反應假說認為Aβ沉積在AD發病機制中起著核心作用，線粒體的功能障礙、Tau蛋白的過度磷酸化和神經元的凋亡、突觸的降解消失等均與Aβ的生成與聚集有關〔7〕。一些研究表明，AD患者早期的記憶和認知功能的缺失與可溶的Aβ寡聚體誘導的突觸功能改變有關。通過毒理學模型觀察到Aβ寡聚體可以導致神經元樹突棘的廣泛損傷，降低突觸傳遞、減弱突觸聯系并引起海馬區神經元的興奮性中毒〔8〕。目前，Aβ對突觸可塑性損傷的具體作用機制尚無定論，研究發現與谷氨酸能系統激活有密切關系。Aβ能降低星形細胞對谷氨酸的再攝取，并影響谷氨酸轉運體-1(GLT-1)和谷氨酸-天冬氨酸轉運體(GLAST)的活性功能，從而導致突觸間隙谷氨酸濃度的異常增高，進而引起了NMDA受體的持續性興奮〔9〕。Mattson等〔10〕還發現Aβ與NMDA受體間存在直接關系，Aβ能直接增強NMDA受體介導的興奮毒性作用，并在海馬區發現NMDA受體激活后表現胞內Ca2+含量的大幅度增加，并且發生NMDA受體激活易化現象。因此NMDA受體介導的谷氨酸興奮毒性在Aβ誘導突觸可塑性損傷中發揮重要作用。

NMDA受體是典型的異構復合體,由NR1亞單位與NR2亞單位(NR2A-NR2D)構成。NR1是NMDA受體的基本亞基，是實現通道功能所必需的；NR2是調節亞基，輔助NMDA受體實現多元化結構，其中NR2B對NMDA受體的結構和功能有十分重要的作用。離體實驗表明NR2B亞基可調節NMDA受體介導的興奮性突觸后電位，影響中樞神經系統的突觸可塑性〔11〕，同時含NR2B的NMDA受體離子通道對Ca2+有較高的通透性〔12〕。

本實驗研究提示Aβ能夠改變NMDA受體復合體的結構和功能，尤其是改變NMDAR1/NMDAR2B型NMDA受體復合體的結構和功能，從而進一步激活NMDA受體，引起胞外Ca2+內流增加，胞內鈣超載，參與NMDA介導的細胞興奮毒性損傷和突觸可塑性破壞過程〔13〕。

ATP敏感性鉀通道(KATP)廣泛分布在中樞神經系統，在生理狀態下通道處于關閉狀態，當細胞能量代謝發生障礙，細胞內ATP濃度降低和(或)氧化應激損傷時，此通道激活，通過感受細胞內ATP/ADP水平直接將細胞代謝狀態與電活動相偶聯，對早期的細胞能量代謝障礙可能產生的細胞線粒體等損傷產生保護作用。KATP 通道分為兩類：一類是存在于細胞膜上的ATP 敏感性鉀離子通道(SarcKATP),另一類是線粒體ATP 敏感性鉀離子通道(MitoKATP)，其中MitoKATP通道被認為是抗細胞損傷的共同效應器〔14〕。二氮嗪是目前常用的MitoKATP通道特異性開放劑，它對MitoKATP通道的開放作用是SarcKATP通道的2 000倍。研究發現，在AD鼠模型中，二氮嗪預處理能部分改善大鼠的學習記憶能力〔3〕，并能使大鼠大腦皮層和海馬部位神經細胞內Bcl-2表達量增加而Caspase-3的表達量降低，可能具有抗細胞凋亡作用〔15〕。另有研究發現，二氮嗪能增強谷氨酸轉運體的功能,進而促進星形膠質細胞對谷氨酸的攝取、降低谷氨酸興奮性毒性〔16〕。Teshima等〔17〕研究報道,二氮嗪預處理可抑制小腦顆粒細胞興奮性谷氨酸的釋放,并認為其可能是通過MitoKATP通道的激活來實現的。

本實驗結果提示Aβ能夠改變NMDA受體復合體的結構和功能，參與NMDA介導的細胞興奮毒性損傷和突觸可塑性破壞過程〔13〕。進一步研究發現，二氮嗪具有拮抗Aβ1～42升高NR2B亞基蛋白表達的作用，提示二氮嗪可能通過影響NMDA受體復合體結構和功能而拮抗Aβ1～42的細胞毒性作用，但其具體分子信號機制正在研究中。

ATP敏感性鉀通道(KATP)可能是腦對各種氧化應激預適應的一個觸發器和/或效應器，KATP通道開放劑作為腦保護劑已經成為科研靶點〔18〕，本實驗證實KATP開放劑二氮嗪預處理拮抗了Aβ1～42升高NR2B亞基蛋白表達的作用，但是NR2B亞單位結構和功能改變在阿爾茨海默病發病機制和藥物防治中具體分子機制仍不清楚，有望為研制新型抗AD藥物提供基本理論依據。

4參考文獻

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〔2013-12-28修回〕

(編輯徐杰)