潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-4動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律

潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-4動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律

朱向東曹燕飛王燕汪斌段永強(qiáng)

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的探討潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-4的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律。方法將60只大鼠隨機(jī)分為空白組10只、乙醇組10只，模型組40只(3、7、14、21 d各10只)，采用TNBS/乙醇灌腸法制備潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，于制模后3、7、14、21 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用ELISA法檢測大鼠血清IL-1β、 TNF-α、IL-4水平，光鏡觀察結(jié)腸組織形態(tài)并評分。結(jié)果制模后3 d大鼠結(jié)腸出現(xiàn)炎癥和潰瘍，且隨著時(shí)間推移而加重，7～14 d潰瘍和炎癥最為嚴(yán)重，21 d潰瘍和炎癥已經(jīng)有所修復(fù)。模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清促炎因子IL-1β、TNF-α均高于空白組和乙醇組，抗炎因子IL-4水平均低于空白組和乙醇組，以7 d和14 d升高或降低更為顯著(P<0.05、P<0.01)； 7、14 d組與3d組比較，IL-1β、 TNF-α水平進(jìn)一步升高(P<0.01)，而IL-4水平進(jìn)一步降低(P<0.01)；21 d組與7、14 d組比較，IL-1β、 TNF-α水平下降，而IL-4水平則升高(P<0.05)。結(jié)論促炎因子IL-1β、 TNF-α和抗炎因子IL-4在UC發(fā)病中起重要作用，UC的發(fā)病及嚴(yán)重程度與促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-4的動(dòng)態(tài)表達(dá)及失衡密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕潰瘍性結(jié)腸炎(UC)；白細(xì)胞介素-1β；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-4

中圖分類號(hào)〔〕R574.62〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(No.81060283)

通訊作者：王燕(1979-)，女，碩士，講師，主要從事中醫(yī)藥防治潰瘍性結(jié)腸炎的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

第一作者：朱向東(1973-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治潰瘍性結(jié)腸炎的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是以腹痛腹瀉、 黏液膿血便持續(xù)或反復(fù)發(fā)作為主要癥狀，具有癌變傾向，屬于難治性消化系統(tǒng)疾病，目前尚缺乏滿意的治療方法。該病發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確。目前促炎細(xì)胞因子及抑炎細(xì)胞因子失衡機(jī)制越來越受到人們的重視〔1〕。體外研究表明促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和抗炎細(xì)胞因子IL-4等可以通過多種病理學(xué)作用參與腸黏膜炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過程〔2〕。本研究通過動(dòng)態(tài)測定UC模型大鼠血清炎性反應(yīng)細(xì)胞因子水平，探討其在UC發(fā)病機(jī)制中的作用。

1資料與方法

1.1動(dòng)物采用SPF級Wistar大鼠30只，體質(zhì)量160～200 g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXKC(甘)2004-0006；SPF級實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2試劑蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、考馬斯亮藍(lán)溶液(20090825)均購自南京建成生物工程公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：購于北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司，由美國Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)為(2008-16-2)；大鼠IL-β、TNF-α、IL-4檢測試劑盒購自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器與設(shè)備Biorad iMark酶標(biāo)儀(美國BLO-RAD公司)；CT14RD高速冷凍離心機(jī)(天美科技有限公司)；303-2型恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器公司) 。

1.4方法

1.4.1造模方法采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型：將大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性將TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門約7～8 cm深的腸腔內(nèi)，留置數(shù)分鐘，讓動(dòng)物保持平躺狀態(tài)，自然清醒。

1.4.2分組與給藥、取材將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組：空白組、乙醇組、模型組(3、7、14、21 d)，每組10只。空白組不處理，模型組均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合試劑灌腸，乙醇組50%乙醇0.25 ml灌腸。分別于制模后3、7、14、21 d分批處死大鼠并取材，乙醚麻醉后于股動(dòng)脈采血，室溫靜置10～20 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清，檢測指標(biāo)。脫頸處死大鼠，剖取病變最嚴(yán)重處結(jié)腸5～8 cm，用冷 PBS清洗結(jié)腸，肉眼觀察結(jié)腸損傷情況并評分。

1.4.3結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分大體形態(tài)損傷參照Luketal標(biāo)準(zhǔn) 0分：無損傷；1分：充血但沒有潰瘍；2分：充血而且腸壁變厚但沒有潰瘍；3分：有一處小潰瘍，直徑約0～1 cm；4分：潰瘍較大，直徑約1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連；5分：潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴(yán)重。

1.4.4指標(biāo)檢測采用ELISA法測定IL-1β、TNF-α，IL-4嚴(yán)格按試劑盒要求操作。在檢測波長450 nm和校正波長620 nm同時(shí)讀板，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1一般狀況各組大鼠造模后第1天均出現(xiàn)懶動(dòng)，扎堆，食量下降，稀便且部分大鼠出現(xiàn)血便；第3天體重開始下降；第7天體重下降明顯，毛色無光澤，食量低于正常，仍有稀便；第14天大鼠活動(dòng)正常，仍有稀便；第21天造模各大鼠毛色晦暗，飲食趨于正常，時(shí)有稀便。乙醇組造模后第1天出現(xiàn)稀便，于第2天癥狀緩解，第3天體重出現(xiàn)增長，7 d后完全恢復(fù)正常。

2.2結(jié)腸組織大體形態(tài)及評分空白組和乙醇組大鼠腸道不增厚，無粘連，腸皺襞紋理清晰，腸黏膜光滑，未見明顯的充血水腫、糜爛及潰瘍。各造模組與乙醇組(0.13±0.35)和空白組(0.10±0.11)相比較，均有顯著差異(P<0.01)。3 d組(1.33±0.98)大鼠腸壁可見明顯充血水腫，腸壁增厚，潰瘍形成；7 d組(2.62±0.87)可見腸道粘連，結(jié)腸縮短，黏膜壞死，呈黑褐色，亦有大鼠可見腸脹氣；14 d組(2.17±0.83)潰瘍開始愈合，大鼠腸道仍然有粘連，偶有腸脹氣出現(xiàn)；21 d組(1.85±0.68)潰瘍面積較7 d組變小，可見愈合后的瘢痕，各大鼠腸壁仍有增厚變硬及腸道粘連，與7 d組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3UC大鼠血清IL-β的動(dòng)態(tài)表達(dá)與空白組和乙醇組比較，各模型組大鼠血清IL-β顯著增高，其中以7 d組升高最為明顯(P<0.01)；與3 d組比較，7 d組IL-β水平升高達(dá)到最高值；與7 d或14 d比較，21 d組IL-β水平又明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.4UC大鼠血清TNF-α的動(dòng)態(tài)表達(dá)與空白組和乙醇組比較，各模型組大鼠血清TNF-α含量明顯升高(P<0.01，P<0.05)，其中尤其以14 d組升高更為顯著(P<0.01)。與7 d或14 d比較，21 d組TNF-α含量又明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.5UC大鼠血清IL-4的動(dòng)態(tài)表達(dá)與空白組和乙醇組比較，各模型組大鼠血清IL-4含量明顯下降(P<0.01，P<0.05)，其中尤其以14 d組下降更為顯著(P<0.01)。與7 d或14 d比較，21 d組IL-4含量又明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1　UC大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-4

與空白組和乙醇組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與3 d組比較：3)P<0.01；與7 d或14 d比較：4)P<0.05

3討論

腸黏膜持續(xù)的炎癥損傷和免疫異常被認(rèn)為是UC發(fā)病的基本機(jī)制〔2〕。細(xì)胞因子失衡是UC產(chǎn)生腸道非特異性炎性反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔3〕。參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子分為促炎和抗炎兩類。TNF-α在UC發(fā)病中被公認(rèn)為是一種促炎細(xì)胞因子，它可以促使腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖、移行和分化，在這一過程中會(huì)釋放大量的非特異性或特異性炎性分子，在腸黏膜局部起到免疫破壞作用，反映到UC則是腸黏膜局限性潰瘍、炎細(xì)胞的出現(xiàn)和延續(xù)。活動(dòng)期UC患者血清TNF-α水平明顯增高,提示TNF-α參與了UC的病理過程〔4〕。TNF-α主要由激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其促炎機(jī)制主要是參與激活中性粒細(xì)胞和上調(diào)黏附分子、促進(jìn)肉芽腫的形成。TNF-α還能夠加強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，刺激IL-8、IL-1等其他細(xì)胞因子合成釋放，產(chǎn)生細(xì)胞因子的瀑布效應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大〔5〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TNF-α的動(dòng)態(tài)表達(dá)與UC的發(fā)病和加重呈正相關(guān)。

IL-1β是誘導(dǎo)炎癥性腸病(IBD)腸道炎癥的一種非常重要的細(xì)胞因子，它能使CD4+T細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞生長、活化以及IL-2R表達(dá)，引起炎癥介質(zhì)釋放〔6〕。IL-1受體拮抗劑IL-1Ra可以通過競爭結(jié)合靶細(xì)胞上的IL-1受體，阻斷IL-1的促炎效應(yīng)。但UC患者IL-1Ra和IL-1β嚴(yán)重失衡，腸上皮細(xì)胞只分泌的IL-1Ra，不足以中和由固有膜單核細(xì)胞分泌的IL-1β等炎性細(xì)胞因子〔7〕，所以，在UC患者會(huì)因?yàn)槟c黏膜IL-1β的大量分泌促使炎癥持續(xù)和加重。IL-1β有多種生物學(xué)效應(yīng)，IL-1β能夠使免疫上調(diào)和促進(jìn)炎癥活性，能通過自分泌或旁分泌促進(jìn)其下游細(xì)胞因子(如TNF-α)的表達(dá)和產(chǎn)生，并和其共同作用，引起一系列腸黏膜損傷和腸道炎癥反應(yīng)。IL-1β還通過促進(jìn)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位，引發(fā)一系列腸組織破壞和腸道炎癥反應(yīng)〔8〕。

有研究表明〔9〕，UC患者腸黏膜IL-4能抑制殺傷細(xì)胞的活性，并抑制腸黏膜固有層單核細(xì)胞的增殖，緩解其細(xì)胞毒性。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明〔10〕，IL-4能抑制炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α的釋放，從而抑制IL-1、TNF-α的促炎作用。

本實(shí)驗(yàn)說明IL-1β、TNF-α、IL-4的表達(dá)與結(jié)腸病理損傷有著高度一致性，IL-1β、TNF-α、IL-4的動(dòng)態(tài)表達(dá)與UC 的發(fā)生和嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)UC的發(fā)病機(jī)制之一是抗炎因子與抑炎因子的平衡遭到了破壞，所以從糾正腸道異常免疫反應(yīng)角度研制治療UC的新藥應(yīng)該是非常重要的思路。

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〔2013-06-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)