內質網應激相關基因在2型糖尿病合并脂肪肝小鼠肝臟中的表達變化

內質網應激相關基因在2型糖尿病合并脂肪肝小鼠肝臟中的表達變化

程莉娟成細華喻嶸1曾辛1

(湖南中醫藥大學醫學院，湖南長沙410208)

摘要〔〕目的探討內質網應激(ERS)在高脂飲食2型糖尿病轉基因MKR小鼠脂肪肝發生中的作用。方法高脂飼料誘發MKR鼠形成脂肪肝，觀察肝臟形態變化，檢測肝臟甘油三酯和脂肪酸水平，RT-PCR檢測小鼠肝臟內質網應激相關基因mRNA表達變化。結果與正常小鼠比較，MKR組小鼠肝臟GRP78、XBP1、FAS、ACC-α、GSK3β mRNA表達水平升高(P<0.05)；與MKR小鼠比較，高脂飲食MKR小鼠肝臟甘油三酯(TG)和脂肪酸(FFA)水平顯著升高(P<0.01)，肝臟GRP78、XBP1、CHOP、SREBP1c 、FAS、ACC-α、GSK3β和EDEM1基因mRNA表達水平均增加(P<0.01)，而ApoB100 mRNA表達水平降低(P<0.01)。結論ERS參與調節肝臟脂質及ApoB100的代謝過程，在轉基因2型糖尿病MKR鼠脂肪肝形成中發揮重要作用。

關鍵詞〔〕內質網應激； 糖尿病合并脂肪肝； MKR小鼠； 脂代謝

中圖分類號〔〕R285.5〔

基金項目：國家自然科學基金(81102593，81273753)；中國博士后科學基金(20110491258)；湖南省科技計劃項目(2014FJ3023)；地方高校國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201210541003)；湖南省中西醫結合基礎重點學科資助

通訊作者：成細華(1974-)，女，教授，博士，主要從事中醫藥防治糖尿病及其并發癥的機制研究。

The related gene expressions of endoplasmic reticulum stress in the liver of type 2 diabetes mice combined with liver steatosis

CHENG Li-Juan,CHENG Xi-Hua,YU Rong,etal.

Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of endoplasmic reticulum stress on the formation of liver steatosis in MKR mice raised by high fat feeds. MethodsMKR mice were raised by high fat feeds to form liver steatosis. The pathological changes of liver were examined,and the levels of TG and FFA in the liver were examined too. RT-PCR was used to analyze the related gene expressions of endoplasmic reticulum stress in the liver. ResultsThe gene expressions of GRP78,XBP1,FAS,ACC-α and GSK3β on mRNA level in MKR mice were elevated slightly in contrast with normal mice(P<0.05). The levels of TG and FFA in the liver were increased remarkably,and the gene expressions of GRP78,XBP1,CHOP,SREBP1c,FAS,ACC-α,GSK3β and EDEM1 on mRNA level in MKR mice with liver steatosis were elevated significantly in contrast with MKR mice(P<0.01),while the gene expression of apoB100 was decreased(P<0.01). ConclusionsThere has a close relationship between the liver steatosis and the involvement of ERS in the lipid metabolism in the liver of MKR mice.

【Key words】Endoplasmic reticulum stress；Diabetes combined with liver steatosis；MKR mice；Lipid metabolism

第一作者：程莉娟(1979-)，女，碩士，主要從事中醫藥防治糖尿病的機制研究。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是2型糖尿病的常見肝臟并發癥〔1〕。根據糖尿病是形成NAFLD的重要原因之一，本課題組以高脂飲食喂養轉基因2型糖尿病 MKR鼠,建立 2型糖尿病并發NAFLD模型。該模型動物的肝質量增加,肝指數上升，肝細胞彌漫性脂肪性變，糖脂代謝紊亂，血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶濃度升高，與臨床2型糖尿病合并 NAFLD極為一致，為糖尿病合并NAFLD機制研究提供一個很好的平臺〔2〕。研究表明，內質網應激(ERS)在2型糖尿病合并NAFLD中具有重要作用〔3，4〕。ERS可能通過影響脂代謝相關基因，如固醇調節元件結合蛋白等的表達，增加肝臟脂肪酸的合成和積聚〔5〕。另外，ERS在肝載脂蛋白(Apo)B100的合成和分泌過程中也具有重要的調節作用，影響并制約肝細胞合成和分泌極低密度脂蛋白〔4〕。目前，ERS在2型糖尿病合并NAFLD發病中的作用尚未完全明了。本研究探討ERS在2型糖尿病合并NAFLD小鼠模型中的作用機制。

1材料與方法

1.1動物8周齡FVB/N野生小鼠購自維通利華，MKR小鼠(采用組織特異過度表達轉基因技術產生)，由美國國立衛生研究院(Dr.D.LeRoith)提供純合子MKR小鼠，經自然交配后繁殖的后代用于實驗研究。上述實驗用小鼠由湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心飼養。

1.2主要試劑TG、FFA測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；動物組織總RNA提取試劑盒(北京TIANGEN生物技術公司)；逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)；PCR引物由上海生工公司合成；2×Taq PCR MasterMIX(北京TIANGEN生物技術公司)。

1.3實驗分組隨機選取8周齡FVB/N野生小鼠10只作為正常對照組。20只8周齡經遺傳鑒定的MKR鼠根據性別、體質量，隨機分為MKR組、MKR高脂組，每組10只。MKR高脂組以高脂飼料喂養，高脂飼料為動物基礎飼料加15%豬油、1%膽固醇。FVB/N野生小鼠、MKR組以基礎飼料喂養8 w，試驗中無小鼠死亡。

1.4肝組織形態學觀察取小鼠肝臟最大葉距邊緣5 mm處肝組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，病理切片，HE染色后光鏡觀察，拍照。同時取一大小約1 mm3的肝組織，4%戊二醛溶液固定，用于透射電鏡(日本JEOL公司1230型)觀察肝臟的超微結構。

1.5肝臟TG和FFA的測定取新鮮肝臟組織，用9 g/L的生理鹽水4℃制備10%的肝勻漿，3 000 rp/min離心15 min，取上清。嚴格按照試劑盒要求測定TG和FFA含量。

1.6RT-PCR檢測MKR小鼠肝組織脂代謝ERS相關基因的表達取各組小鼠新鮮肝臟組織，用動物組織總RNA提取試劑盒抽提其總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度。取1 μg總RNA，用逆轉錄試劑盒以Oligo(dT)為引物進行逆轉錄反應。使用DNAStar 6.0軟件，根據GenBank中小鼠的ERS相關靶基因葡萄糖調節蛋白(GRP)78、X盒結合蛋白(XBP)1、C/EBP同源蛋白(CHOP)、固醇調節元件結合蛋白(SREBP)1c、脂肪酸合酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC-α)、糖原合酶激酶(GSK3)β、Apo B100和內質網甘露糖苷酶樣蛋白(EDEM)1 mRNA序列設計PCR引物(見表1)。選擇最適條件分別對小鼠肝臟靶基因和內參基因β-肌動蛋白(β-actin)進行PCR擴增。PCR產物進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描分析系統拍照并分析電泳條帶灰度值，以靶基因與β-actin電泳條帶密度比值計算各靶基因mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

表1　小鼠肝臟內質網相關基因RT-PCR引物序列

2結果

2.1肝臟組織形態學變化見圖1。FVB/N野生小鼠和MKR鼠肝臟大體形態基本相似，MKR鼠肝臟色澤較深；MKR高脂組小鼠肝臟外觀呈彌漫性腫大，邊緣鈍而厚，質如面團，表面色澤蒼白。光鏡下，FVB/N野生小鼠和MKR鼠肝臟肝小葉結構正常；肝細胞排列規則成條索狀，以中央靜脈為中心，呈放射狀分布，肝細胞大小正常，胞核位于細胞中央。MKR高脂組小鼠肝細胞大泡性脂變混有小泡性脂變，在大泡性脂變為主的細胞中，胞核擠至邊側。 電鏡下，FVB/N野生小鼠和MKR鼠肝細胞形態結構正常，有豐富的線粒體。MKR高脂組小鼠肝細胞內堆滿大小不一的脂滴。

2.2肝臟TG和FAA含量檢測結果見表2。與正常對照組比較，MKR組小鼠肝臟TG和FAA含量增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。與MKR組小鼠比較，MKR高脂組小鼠肝臟TG和FAA含量異常增加(P<0.01)。

A：肝臟大體形態(左：MKR組；中：MKR高脂組，右：FVB/N野生小鼠)；B1：MKR組(HE，×400)；B2：MKR高脂組(HE，×400)；C1：MKR組(EM，×9 700)；C2：MKR高脂組(EM，×9 700)　 圖1　各組小鼠肝臟病理變化

組別nTG(μmol/g)FAA(μmol/g)正常對照組1024.64±2.5528.24±4.12MKR組1026.50±4.2130.21±5.35MKR高脂組1052.94±5.731)102.23±12.281)

與MKR組比較：1)P<0.01

2.3肝臟內質網應激和脂代謝相關基因表達變化見圖2、表3。與正常對照組比較，MKR組小鼠肝臟GRP78、XBP1、FAS、ACC-α、GSK3β mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；CHOP、SREBP1c和EDEM1 mRNA表達升高，ApoB100 mRNA表達降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。與MKR組小鼠比較，MKR高脂組小鼠肝臟內質應激和脂代謝相關基因mRNA表達異常進一步加劇，GRP78、XBP1、CHOP、SREBP1c 、FAS、ACC-α、GSK3β 和EDEM1 mRNA表達水平均顯著增加(P<0.01)，而ApoB100 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。

表3　小鼠肝臟ERS相關基因mRNA

與正常對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與MKR組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

M：電泳Marker；NG：正常對照組；MG：MKR組；HG：MKR高脂組 圖2　小鼠ERS相關基因RT-PCR電泳結果

3討論

肥胖、糖尿病、高脂血癥被認為是NAFLD患者脂肪肝發生發展的危險因素〔6〕。本研究所選骨骼肌特異性胰島素樣生長因子1受體功能缺失鼠(MKR鼠)在出生5 w左右即可表現為顯著的肌肉、肝臟、脂肪組織胰島素抵抗及高血糖、胰島β細胞功能紊亂等情況〔7，8〕。盡管MKR鼠肝臟TG及FFA水平較FVB/N野生鼠有升高趨勢，但差異沒有統計學意義，且肝臟組織形態學未見病理改變。而高脂飲食MKR鼠肝臟TG及FFA水平則顯著升高，光鏡及電鏡下更可見大泡和小泡混合性肝細胞脂肪變性明顯，表明該2型糖尿病合并NAFLD動物模型建立成功。

內質網是蛋白質合成、折疊、運輸以及儲存鈣的主要場所，對各種刺激極為敏感。當機體功能紊亂時，錯誤折疊和未折疊的蛋白在腔內聚集且細胞內鈣平衡紊亂的狀態稱為ERS〔9〕。近年來，研究表明ERS介導了肥胖、T2DM以及NAFLD等病變生理過程〔3，4，10〕。一方面，細胞通過非折疊蛋白反應(UPR)來適應ERS。位于內質網的肌醇需要酶(IRE)1、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)和活化轉錄因子(ATP)6是UPR反應的信號轉導蛋白。當內質網內非折疊或錯誤折疊蛋白積累時，GRP78與上述3種信號轉導蛋白解離并激活它們。激活的IRE1則催化轉錄調節蛋白XBP1 mRNA剪切表達〔11〕。XBP1+/-小鼠肝臟中ERS反應增強，同時胰島素信號傳導效率降低，在高脂飲食誘導的條件下容易產生IR和2型糖尿病〔10〕。早期ERS通過激活UPR及時有效逆轉內質網的內環境增強細胞存活能力，但ERS持續存在，凋亡勢必為最終結果。CHOP是一種ERS特異轉錄因子，當各種應激情況出現后表達顯著增加，影響細胞的存活。Oyadoman等〔12〕發現CHOP基因敲除后可增強細胞對抗ERS所致凋亡的能力，阻止2型糖尿病的發生。因此，GRP78、XBP1和CHOP被廣泛視為ERS的標志性分子。本實驗結果揭示，MKR小鼠肝臟GRP78、XBP1 mRNA表達水平較FVB/N野生鼠明顯升高，表明MKR鼠體內已開始誘發ERS。而高脂飲食MKR小鼠肝臟上述3種基因的mRNA表達水平較MKR鼠進一步升高，表明高脂飲食MKR小鼠肝臟ERS程度加劇。

ERS還直接通過影響脂代謝相關基因，導致肝細胞脂肪合成增多，在2型糖尿病并發脂肪肝中具有重要作用〔5，13〕。ERS時可激活內質網上的膜連接蛋白SREBP1c作為轉錄因子進入胞核，調控靶基因包括脂肪合成酶如ACC-α、FAS等的表達〔14〕。當SREBP-1c表達上調至超過機體的自我調節及適應能力時，則引起其靶基因過度表達，FFA合成異常增多，肝臟脂質代謝障礙，更易導致NAFLD的發生〔15〕。 李小山等〔16〕高脂喂養大鼠12 w后，肝臟ACC-α、FAS基因在 mRNA和蛋白質水平上表達均顯著升高，形成NAFLD。ERS還能調節肝臟中ApoB100合成和分泌，通過減少VLDL形成來減少肝脂肪輸出，加劇肝細胞中脂肪堆積〔17〕。另外，ERS可以通過JNK(c-JUN NH2 terminal kinase)途徑激活GSK3β的表達，激活下游膽固醇/甘油三酯合成和攝取相關基因表達，促進肝細胞內FFA和膽固醇的積累〔18〕。本實驗中，MKR鼠肝臟脂肪酸合成相關基因僅FAS、ACC-ɑ以及GSK3β mRNA表達水平較FVB/N野生鼠明顯升高，而高脂喂養的MKR小鼠肝臟SREBP1c、FAS、ACC-ɑ以及GSK3β mRNA表達水平較MKR鼠均顯著增加，ApoB100表達則顯著下降，表明ERS加劇了脂代謝紊亂。

EDEM1是通過XBP1作用產生的一種α-甘露糖苷酶樣應激蛋白，能促進ERS時產生的不完全折疊或錯誤折疊蛋白的降解，是內質網相關性降解途徑的標志分子之一〔19〕。研究發現高脂飲食T2DM小鼠在18周齡時肝臟EDEM1 mRNA表達顯著增加，可能影響了2型糖尿病小鼠肝臟ApoB100和VLDL合成和分泌，加速了脂肪肝的形成〔4〕。本實驗中，高脂喂養的MKR小鼠肝臟較FVB/N野生鼠、MKR小鼠同樣EDEM1m RNA表達明顯升高，這進一步表明高脂飲食MKR鼠ERS增加了肝臟脂質積累，更易導致脂肪肝。

綜上所述，高脂喂養的MKR鼠，從生化及組織形態學上均顯示肝臟存在脂肪性變。同時，研究結果表明2型糖尿病MKR鼠肝臟內存在ERS，導致少數脂代謝相關基因FAS、ACC-ɑ以及GSK3β mRNA表達水平升高，但在實驗期間暫未形成脂肪肝；以高脂喂養的MKR鼠肝臟脂代謝相關基因SREBP1c 、FAS、ACC-ɑ、GSK3β、ApoB100和EDEM1 mRNA表達均異常增加，說明高脂飲食加劇了MKR鼠肝臟ERS，ERS進而又促進肝臟脂類合成，抑制肝臟脂類輸出，從而參與肝臟脂肪性變。肝臟ERS和脂代謝相關基因蛋白表達的差異有待進一步研究。因此，本研究可為T2DM合并NAFLD的治療提供新靶點。

4參考文獻

1周慧，王剛，郭麗萍.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝患病率的回顧性分析〔J〕.河北醫藥，2010；32(5)：583-84.

2成細華，喻嶸，明霞，等.2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝動物模型的建立〔J〕.胃腸病學和肝病學雜志，2011；20(1)：77-80.

3Le AH,Scapa EF,Cohen DE,etal.Regulation of hepatic lipogenesis by the transcription factor XBP1〔J〕.Science,2008;320(5882):1492-6.

4毛劉峰，姜小偉，秦艷，等.內質網應激對2型糖尿病小鼠脂肪肝發生的影響〔J〕.世界華人消化雜志，2009；17(1)：4-10.

5陸金來，陳金聯，陳明祥，等.肝臟脂肪酸在高脂飲食大鼠非酒精性脂肪性肝病模型中的代謝〔J〕.世界華人消化雜志，2008；16(16)：1728-33.

6McClain CJ,Mokshagundam SP,Barve SS,etal.Mechanisms of non-lcoholic steatohepatitis〔J〕.Alcohof,2004;34(1):67-79.

7喻嶸，成細華，胡偉，等.骨骼肌特異性胰島素樣生艮因子l及胰島素雙受體功能缺失鼠糖尿病發病及其相關炎癥因子的變化〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2007；11(45)：9075-8.

8Kim H,Penni8i P,Zhao H,etal.MKR mice are resistant to the metaboIic actions of both insulin and adiponectin：discordance between insulin resistance and adiponectin responsiveness〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2006;291(2)：E298-305.

9Lai E,Reodoro T,Volchuk A.Endoplasmic reticulum stress:signaling the unfolded protein response〔J〕.Physiology(Bethesda),2007;22(3):193-201.

10Ozcan U,Yilmaz E,Ozcan L,etal.Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes〔J〕.Science,2006;313(5790):1137-40.

11Malhi H,Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress in liver disease〔J〕.J Hepatol,2011;54(4):795-809.

12Oyadoman S,Mori M.Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress〔J〕.Cell Death Differ,2004;11(4):381-9.

13Ota T,Gayet C,Ginsberg HN.Inhibition of apoliporotein B100 secetion by lipid-induced hepatic endoplasmic reticulum stress in rodents〔J〕.J Clin Invest,2008;118(1):316-32.

14Raghow R,Yellaturu C,Deng X,etal.SREBPs:the crossroads of physiological and pathological lipid homeostasis〔J〕.Trends Endocrinol Metab,2008;19(2):65-73.

15 Ahmed MH,Byrne CD.Modulation of sterol regulatory element binding proteins(SREBPs)as potential treatments for non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)〔J〕.Drug Discov Today,2007;12(17-18):740-7.

16李小山，何松.ChREBP及其靶基因在高脂大鼠非酒精性脂肪肝中的表達〔J〕.重慶醫學，2011；40(21)：2125-27.

17Su Q,Tsai J,Xu E,etal.Apoliporotein B100 acts a molecular link between lipid-induced endoplasmic reticulum stress and hepatic insulin resistance〔J〕.Hepatology,2009;50(1):77-84.

18Kim AJ,Shi Y,Austin RC,etal.Valproate protects cells from ER stres-induced lipid accumulation and apoptosis by inhibiting glycogen synthase kinase-3〔J〕.J Cell Sci,2005;118(Pt1):89-99.

19Sundar Rajan S,Srinivasan V,Balasubramanyam M,etal.Endoplasmic reticulum(ER)stress and diabetes〔J〕.Indian J Med Res,2007;125(3):411-24.

〔2013-07-18修回〕

(編輯徐杰)