蘆薈凝膠促進糖尿病創面潰瘍愈合的機制

蘆薈凝膠促進糖尿病創面潰瘍愈合的機制

張揚朱平徐剛賴美錚熊曉清郭堅

(暨南大學醫學院第四附屬醫院廣州市紅十字會醫院內分泌科，廣東廣州510220)

摘要〔〕目的在分子水平探討蘆薈凝膠促進糖尿病創面潰瘍愈合的機制。方法實驗分為3組，A組為正常組，B組和C組應用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型并建立全皮傷口模型，B組給予生理鹽水處理創面，C組給予蘆薈凝膠干預，4次/d，通過膠原纖維-Masson三色法和免疫組織化學法評估傷口形成后3、7、14 d皮膚組織的組織病理學改變，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測大鼠皮膚基質金屬蛋白酶(MMPs)-9和金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)-1 mRNA的表達情況。結果B組大鼠傷口愈合明顯遲緩。蘆薈凝膠干預可加速糖尿病大鼠大鼠傷口愈合。傷口愈合過程中，B組MMP-9 mRNA水平持續高于A組(P<0.01)，而TIMP-1 mRNA水平持續低高于A組(P<0.01)；給予蘆薈凝膠干預的C組MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA水平僅在傷口形成第3天與A組相比具有統計學差異，其余時間點均與A組相近。蘆薈凝膠干預可降低大鼠傷口組織MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值。結論糖尿病大鼠皮膚傷口愈合速度明顯減慢，蘆薈凝膠干預可加速糖尿病大鼠傷口愈合，蘆薈凝膠的這種作用可能是通過調控MMP-9 /和TIMP-l水平實現的。

關鍵詞〔〕蘆薈凝膠；MMP-9；TIMP-1；糖尿病

中圖分類號〔〕R587〔

基金項目：廣東省建設中醫藥強省立項科研課題(20132008)；廣東省臨床用藥研究基金(2013X05)

第一作者：張揚(1971-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事糖尿病及其慢性并發癥的防治研究。

糖尿病創面難愈性病變是糖尿病的主要慢性并發癥之一,也是糖尿病致殘、致死的重要原因。據報道〔1〕每30秒全球就有1例糖尿病足潰瘍導致截肢。因此，促進糖尿病創面潰瘍的愈合具有重要臨床意義。蘆薈是一種集藥食、保健、美容和觀賞于一體的植物，用于治療瘡瘍歷史悠久，療效確切，無明顯不良反應，但其促進糖尿病創面愈合的作用機制尚未明確。本研究擬從基因水平探討蘆薈凝膠對糖尿病鼠皮膚創面愈合的干預作用及其可能的機制。

1材料與方法

1.1糖尿病大鼠模型的建立選用250 g左右SPF級雄性SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，隨機分為3組，A組為正常組，B組和C組糖尿病組，每組再根據檢測時間點隨機分為0 d組、3 d組、7 d組、14 d組，每組7只。飼養1 w后，糖尿病組大鼠給予連續3 d的40 mg/kg鏈脲佐菌素腹腔內注射誘導糖尿病，正常組大鼠給予等量枸櫞酸-枸櫞酸鈉液作為對照。3 d后于大鼠尾靜脈采血檢測隨機血糖水平，并觀察體重變化。若注射后隨機血糖≥16.7 mmo/L則為糖尿病模型建立成功。所有大鼠實驗期間均自由進食、飲水，每周監測體重和血糖。糖尿病組大鼠根據血糖水平給予1～3 U/d的魚精蛋白鋅胰島素皮下注射，以維持血糖水平在16.7 mmo/L以上，并可降低酮癥的發生，降低模型大鼠死亡率。

1.2皮膚傷口模型的建立〔2〕和取材糖尿病模型建成6 w后，腹腔注射水合氯醛300 mg/kg麻醉，減去大鼠背部毛，75%酒精消毒，用手術刀在大鼠背部正中距顱骨1 cm處制造一個1.3 cm×1.3 cm的正方形傷口，切除范圍深達筋膜層。傷口愈合過程中如出現傷口局部皮膚紅腫、滲液等細菌感染征象，則排除在研究之外。傷口形成后3 d、7 d和14 d，切除大鼠直至筋膜的整個傷口(包括傷口周圍的5 mm內的正常皮膚)，標本的一半以4%發熱多聚甲醛固定，用于HE、免疫組化和Masson染色，其余一半凍存于液氮中，用于后續的組織基質金屬蛋白酶(MMP)-9和金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1 mRNA表達分析。

1.3蘆薈凝膠的制作及治療方法取中華蘆薈鮮葉200 g，洗凈，將蘆薈表皮切除后于粉碎機中粉碎成漿狀，用外用藥膏盒分裝封口，于2℃～4℃低溫保存備用，每4 d制備1次。實驗組給予蘆薈凝膠外涂，4次/d。

1.4免疫組織化學和Masson染色CD68免疫組化染色評價巨噬細胞浸潤情況， Masson染色法評價膠原纖維含量。免疫組化(S-P法)操作步驟參見說明書進行；Masson染色步驟：石蠟切片常規脫蠟至水，滴加Masson復合染色液后蒸餾水沖掉染液，加入磷鉬酸染色后滴加苯胺藍蒸餾水稍沖，即滴加分化液分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封固。

1.5傷口愈合過程中組織學評分組織切片HE染色后，顯微鏡下觀察以下指標：①表皮和真皮的再生情況；②新生肉芽組織厚度；③新生血管形成情況；④基質(膠原纖維)密度；⑤巨噬細胞浸潤情況。評分標準參見文獻報道〔3〕。

1.6RNA提取及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析上述標本使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織，加1 ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen)，使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。引物序列：MMP-9上游引物：5′-AGCCTGTGGTTGGTCAGAAG-3′，下游引物：5′-GTCCGGTTTCAGCATGTTTT-3′,TIMP-1上游引物：5′-GGTTCCCTGGCATAATCTGA-3′，下游引物：5′-GTCATCGAGACCCCAAGGTA-3′。

1.7統計學處理用SPSS16.0 軟件行t或ANOVA檢驗。

2結果

2.1糖尿病大鼠模型建立及傷口愈合情況SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素3 d后，各時間點隨機血糖均高于16.7 mmol/L， 糖尿病大鼠建模6 w末，與A組相比，B組和C組大鼠體重分別下降42%和43%〔A組：(201.46±18.89)g，B組：(198.91±18.42)g，C組：(345.55.46±34.48)g〕；傷口形成后第3天，A組傷口愈合率高于B組和C組(t=22.37，P<0.01；t=21.02，P<0.01)，傷口形成后第7天，A組傷口愈合率高于B組和C組(t=32.11，P<0.01；t=20.28，P<0.01)，而C組傷口愈合率高于B組(t=14.73，P<0.01)，傷口形成后第14天，A組和C組傷口愈合率均高于B組(t=12.47，P<0.01；t=9.97，P<0.01)，A組和C組間差異不具有統計學意義(t=1.96，P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠傷口愈合情況比較

與相應時間點B組相比：1)P<0.01；與相應時間點C組相比：2)P<0.01；下表同

2.2傷口組織學和病理生理學變化傷口形成后第3天，3組膠原得分差異無統計學意義，傷口形成后第7天，A組膠原得分高于B組和C組(t=25.35，P<0.01；t=21.45，P<0.01)，而C組膠原得分高于B組(t=13.29，P<0.01)，傷口形成后第14天，A組和C組膠原得分均高于B組(t=32.14，P<0.01；t=31.45，P<0.01)，A組和C組間差異不具有統計學意義(t=1.36，P>0.05)。傷口形成后第3天， 3組大鼠傷口周圍纖維細胞和單核巨噬細胞浸潤、傷口局部肉芽組織厚度、新生血管形成和再上皮化間差異不具有統計學意義；傷口形成后第7天，B組大鼠傷口周圍纖維細胞和單核巨噬細胞浸潤(t=38.22，P<0.01；t=26.36，P<0.01)、肉芽組織厚度(t=22.35，P<0.01；t=13.47，P<0.01)、新生血管形成(t=19.38，P<0.01；t=12.79，P<0.01)和再上皮化(t=25.89，P<0.01；t=19.96，P<0.01)均落后于A組和C組，而C組大鼠傷口周圍纖維細胞和單核巨噬細胞浸潤(t=24.32，P<0.01)、肉芽組織厚度(t=15.44，P<0.01)、新生血管形成(t=12.35，P<0.01)和再上皮化(t=20.11，P<0.01)仍落后于A組，至傷口形成后第14天，B組大鼠傷口周圍纖維細胞和單核巨噬細胞浸潤(t=40.11，P<0.01；t=38.69，P<0.01)、肉芽組織厚度(t=25.88，P<0.01；t=23.18，P<0.01)、新生血管形成(t=26.17，P<0.01；t=23.83，P<0.01)和再上皮化仍落后于A組和C組，而A組和C組間差異無統計學意義。見表2。

2.3MMP-9 和TIMP-1 mRNA水平的變化傷口形成第0天，各組MMP-9 和TIMP-1 mRNA均呈低水平的表達，B組和C組MMP-9 mRNA水平高于A組(t=38.36，P<0.01；t=36.46，P<0.01)，而TIMP-1 mRNA水平低于A組(t=37.46，P<0.01；t=36.26，P<0.01)；傷口形成后第3天，A組MMP-9 mRNA低于B組和C組(t=32.56，P<0.01；t=25.23，P<0.01)，而C組MMP-9 mRNA高于B組(t=11.25，P<0.01)，TIMP-1 mRNA水平變化與MMP-9 mRNA水平變化相反；傷口形成后第7、14天，A組和C組MMP-9 mRNA均低于B組(t=10.57，P<0.01；t=8.35，P<0.01)(t=19.46，P<0.01；t=17.97，P<0.01)，而TIMP-1 mRNA高于B組(t=22.35，P<0.01；t=19.45，P<0.01)(t=11.35，P<0.01；t=10.017，P<0.01)，A組和C組間差異無統計學意義(t=1.88，P>0.05)，(t=1.01，P>0.05)。見表3。

表2　各組大鼠傷口組織學和病理生理學變化 ± s, n=7)

表3　各組大鼠MMP-9 和TIMP-1 mRNA水平變化

2.4MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值變化傷口形成第0天，B組和C組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值顯著高于A組(t=13.47，P<0.01；t=12.45，P<0.01)，傷口形成后第3天，A組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值低于B組和C組(t=36.35，P<0.01；t=15.35，P<0.01)，且A組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值低于C組(t=8.25，P<0.01)；傷口形成后第7、14天，A組和C組MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值低于均低于B組(t=40.57，P<0.01；t=38.56，P<0.01)(t=50.46，P<0.01；t=47.97，P<0.01)，A組和C組間差異不具有統計學意義(t=1.29，P>0.05；t=1.02，P>0.05)。見表4。

表4　各組大鼠MMP-9 mRNA/

3討論

難愈創面主要與細菌負荷、生長因子減少、血流減少、蛋白酶水平升高和創面修復細胞的表型改變等多種因素有關〔4〕。傷口愈合是一個復雜且精細的過程，由多種細胞和分子參與，它們彼此之間相互協調共同完成傷口修復。正常的傷口愈合由凝血期、炎癥期、增生期、修復期所組成，各個階段之間沒有明顯的界限，它們連續發生并相互交錯。其中，細胞移行、肉芽組織形成、新生血管化以及基質重塑等均與細胞外基質(ECM)有關〔5〕。MMPs和TIMPs是調節細胞外基質的重要成分，是胞外基質降解最主要的水解系統，在ECM合成和降解的代謝平衡中MMPs/TIMPs兩個酶系統起著非常重要的作用。它們在胚胎形成、傷口愈合、腫瘤轉移、類風濕關節炎等過程中MMPs/TIMPs均發揮重要作用〔6，7〕。

MMPs是一組鋅依賴性肽鏈內切酶，能夠降解ECM和非基質蛋白。現已發現的MMPs至少有16種，它們可以降解多種細胞外基質成分，包括膠原纖維、彈性纖維、纖維連接蛋白、層粘連蛋白。這些細胞外基質的降解則為其他細胞遷移至傷口處以及新生血管的穿入提供了空間，并且同時也刺激了新的細胞外基質的形成〔8〕。TIMPs由多基因家族成員組成，分為TIMP-1、2、3和4，主要由巨噬細胞和結締組織細胞合成分泌，能與MMPs的催化區以1∶1可逆性結合，抑制MMPs的活性。TIMP-1主要與MMP-9和MMP-9酶原結合，同時也可與MMP-1、MMP-3結合形成1∶1化學復合物，因此局部創面過度表達具有生理活性的TIMP-1可能抑制創面組織中MMP-9活性。TIMP-1除了抑制MMPs的活性外，還具有調節細胞生長、抗凋亡和促遷移作用〔9〕，如(1)TIMP-1能促進角質形成細胞、成纖維細胞等有絲分裂作用；(2)抗凋亡作用，在體外能夠通過激活PI3K/Akt通路抑制血管內皮細胞凋亡；(3)刺激角質形成細胞遷移作用。 我們已有的研究提示MMP-9/TIMP-1的表達失衡與創面難愈密切相關〔10〕。且文獻報道，糖尿病大鼠皮膚在組織結構完整性未遭到破壞的情況下已存在組織學、細胞生物學行為及MMP-9/TIMP-1水平的改變〔11〕，本研究結果證實在傷口形成第0天，糖尿病組大鼠的MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值即著高于正常對照組。創面形成后，糖尿病組大鼠皮膚傷口愈合速度明顯減慢，愈合過程中MMP-9 mRNA水平顯著升高，TIMP-1mRNA水平相對減少，各個時間點糖尿病鼠傷口組織中MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值明顯增加。

中藥外治法是臨床治療瘡瘍的一種常用方法，蘆薈是其中的常用藥物之一。蘆薈味苦性寒，歸肝、胃、大腸經，具清肝熱、通便等功效，可用于通便、抗炎、調節免疫、抗菌、降低血糖、抗潰瘍乃至抗腫瘤等〔12〕，已為許多國家的藥典所收載。近年來，國內外逐步開展了一些關于蘆薈抗糖尿病作用的實驗研究。Rajasekaran等〔13〕用蘆薈膠的乙醇提取物對正常空腹大鼠、口服葡萄糖的大鼠和STZ誘導的糖尿病大鼠的研究結果表明，蘆薈提取物能通過對糖代謝酶的控制來維持葡萄糖的代謝平衡。Ngo等〔14〕報道了蘆薈在治療糖尿病大鼠傷口愈合方面的促進作用，大鼠背部的傷口通過蘆薈膠局部敷藥或口服等治療方法，待傷口組織愈合后檢測膠原質、氨基乙醣、傷口及皮膚的愈合速度等，結果表明蘆薈可能通過影響炎癥狀態，纖維素增生、膠原質合成及傷口愈合過程等而起到治療糖尿病傷口作用。本研究結果提示，蘆薈凝膠可加速糖尿病大鼠大鼠傷口愈合；且在傷口愈合過程中，蘆薈凝膠干預可降低大鼠傷口組織MMP-9/TIMP-1 mRNA比值。綜上，蘆薈凝膠具有加速糖尿病大鼠傷口愈合的作用，而這種作用可能是通過調控MMP-9 /和TIMP-1水平實現的。

4參考文獻

1Tomesova J,Lacigova S,Cechurova D,etal.Unusual cause of foot defect in patient with diabetes mellitus〔J〕. Vnitr Lek,2012;58(11):875-7.

2王春田,王莉,石巖.2型糖尿病動物模型制備方法探討〔J〕. 實用中醫內科雜志,2011;25(4):27-30.

3Galeano M，Altavilla D，Cucinotta D，etal．Recombinant human erythropoietin stimulates angiogenesis and wound healing in the genetically diabetic mouse〔J〕．Diabetes，2004;53(9):2509-17．

4Cowman S,Gethin G,Clarke E,etal.An international eDelphi study identifying the research and education priorities in wound management and tissue repair〔J〕. J Clin Nurs,2012;21(3-4):344-53.

5Choi JS,Kim JD,Yoon HS,etal.Full-thickness skin wound healing using human placenta-derived extracellular matrix containing bioactive molecules.〔J〕. Tissue Eng Part A,2013;19(3-4):329-39.

6Estella C,Herrer I,Atkinson SP,etal.Inhibition of histone deacetylase activity in human endometrial stromal cells promotes extracellular matrix remodelling and limits embryo invasion.〔J〕. PLoS One,2012;7(1):e30508.

7Wang JG,Ruan J,Li CY,etal.Connective tissue growth factor,a regulator related with 10-hydroxy-2-decenoic acid down-regulate MMPs in rheumatoid arthritis.〔J〕. Rheumatol Int,2012;32(9):2791-9.

8Luizon MR,Amaral LM,Palei AC.Matrix metalloproteinases(MMPs) and tissue inhibitors of MMPs genetic polymorphisms and plasma levels in hypertensive disorders of pregnancy〔J〕. J Hum Hypertens,2012;24(7):938-45.

9Pitiyage GN,Lim KP,Gemenitzidis E,etal.Increased secretion of tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 2(TIMPs -1 and -2) in fibroblasts are early indicators of oral sub-mucous fibrosis and ageing〔J〕. J Oral Pathol Med,2012;41(6):454-62.

10朱平,嚴勵.基因治療與皮膚創面愈合〔J〕. 國際外科學雜志,2009;29(2):281-4.

11嚴勵,朱平,陳黎紅,等.MMP-9/TIMP-1表達失衡與糖尿病大鼠皮膚"隱性損害"關系的初步探討〔J〕. 中華內分泌代謝雜志,2008;24(5):533-6.

12孫培.蘆薈的藥理作用研究進展〔J〕. 湖北中醫雜志,2012;34(4):79-80.

13Rajasekaran S,Sriram N,Arulselvan P,etal.Effect of aloe vera leaf gel extract on membrane bound phosphatases and lysosomal hydrolases in rats with streptozotocin diabetes.〔J〕. Pharmazie,2007;62(3):221-5.

14Ngo MQ,Nguyen NN,Shah SA.Oral aloe vera for treatment of diabetes mellitus and dyslipidemia〔J〕. Am J Health Syst Pharm,2010;67(21):1804,1806,1808.

〔2013-06-15修回〕

(編輯徐杰)