α-硫辛酸對大鼠急性胰腺炎相關腎損傷的保護作用

α-硫辛酸對大鼠急性胰腺炎相關腎損傷的保護作用

趙麗梅馮志杰高軍萍孫澤明宋梅

(河北醫科大學第二醫院消化內科，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的探討α-硫辛酸(ALA)對急性胰腺炎(AP)大鼠腎臟細胞間黏附分子(ICAM)-1與血管細胞間黏附分子(VCAM)-1表達水平的影響及其在氧化應激損傷中的保護作用及機制。方法采用3.5%牛磺膽酸鈉逆行胰膽管注射制備AP大鼠模型，將雄性Wistar大鼠72只。隨機分為3組，假手術組(SO組,n=24)、AP組(n=24)、ALA治療組(ALA組,n=24)，于造模后腹腔內注射ALA(1 mg/kg)，各組以不同時間點3 h、6 h、12 h分為3個亞組，每個亞組為8只大鼠。采用生化法測定血清的淀粉酶及腎功能肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)水平；硫代巴比妥酸法檢測腎組織勻漿中丙二醛(MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活力；應用HE染色觀察腎臟組織病理學變化，免疫組織化學(SP)法檢測腎組織中ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達。結果在AP組各時間點血清淀粉酶、Cr、BUN及腎組織中MDA含量均較SO組顯著升高，而腎組織的SOD活力則明顯降低，光鏡下HE染色可見腎近曲小管上皮細胞變性、壞死，腎小球淤血，腎間質內大量炎性細胞浸潤。免疫組化法染色后觀察在SO組腎組織中幾乎沒有ICAM-1與VCAM-1的表達，而在AP組中則有較強的表達。與AP組相比，在ALA組血清淀粉酶、Cr、BUN及腎組織MDA含量較AP模型組明顯降低，SOD活力則明顯升高，給予ALA治療后組織損傷明顯改善，僅有腎小管上皮細胞輕度水腫，炎性細胞浸潤已不明顯，ICAM-1與VCAM-1表達明顯減弱。結論AP大鼠存在腎臟氧化應激損傷和腎臟炎性細胞因子的激活，ALA可以通過其抗氧化作用以及抑制炎性細胞因子ICAM-1與VCAM-1的表達對大鼠AP相關腎損傷發揮保護作用。

關鍵詞〔〕α-硫辛酸；急性胰腺炎；腎損傷

中圖分類號〔〕R576〔

基金項目：河北省醫學科學研究重點課題計劃基金(No.20110089)

通訊作者：馮志杰(1963-)，男，教授，主任醫師，主要從事消化內科疾病研究。

第一作者：趙麗梅(1976-)，女，主管檢驗師，碩士，主要從事消化內科疾病研究。

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥之一，近年來發病率明顯增多，盡管大部分的胰腺炎表現為輕度，但據文獻統計約22.5%的病人會發生全身炎癥反應綜合征(SIRS)，繼之發展為多器官障礙綜合征(MODS)，成為重癥急性胰腺炎(SAP)，其病情兇險，并發癥涉及全身各臟器〔1〕。研究顯示SAP伴急性腎損傷(AKI)病人發生MODS的概率很高(88.1%)而且發展至急性腎衰竭(ARF)后病死率高達80%，出現ARF后其他臟器衰竭發生率也明顯上升〔2，3〕，因此，早期預防、治療AP患者的腎損傷具有重要臨床意義。圍繞AP相關腎損傷的機制有著眾多的研究，其中炎性介質、細胞因子以及氧自由基的作用是目前研究的熱點。本文通過建立AP腎損傷的模型并給予抗氧化劑α-硫辛酸(ALA)作為治療，通過檢測腎功能、腎臟病理學，細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞間黏附分子-1(VCAM-1)在腎組織中的蛋白表達及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等氧化應激指標，以探討ALA對AP相關腎損傷的保護作用及機制。

1材料與方法

1.1實驗動物72只清潔級成年健康雄性Wistar大鼠，體重(250±25)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。全部動物均在同一實驗室按清潔級大鼠要求專人飼養，自由進食水。實驗過程符合中華人民共和國的《實驗動物管理條例》及倫理要求。

1.2主要試劑MDA及SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所；多克隆兔抗ICAM-1抗體、多克隆兔抗VCAM-1抗體、免疫組織化學SP試劑盒以及DAB顯色劑均購自武漢博士德生物技術公司；?；悄懰徕c與ALA均購自美國Sigma公司。

1.3動物模型建立采用3.5%?；悄懰徕c0.1 ml/kg逆行胰膽管注射建立雄性SD大鼠AP模型。具體操作方法如下：選取清潔健康雄性Wistar大鼠，準確稱質量，標記，隨機分組。大鼠實驗前24 h開始禁食，自由飲水。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔內注射麻醉，取仰臥位，將動物四肢及頭固定于操作臺上，備皮、消毒、鋪無菌洞巾，于上腹正中作2 cm切口進入腹腔，顯露胰膽管，在近肝門處用無創血管夾夾閉胰膽管后，用4號加工鈍頭頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2 ml/min速度注入3.5%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g)，推藥后用無創血管夾夾住胰膽管入十二指腸處，觀察10 min，去除血管夾，關腹，經胰腺病理學證實AP造模成功。

1.4實驗分組將72只大鼠隨機分成3組，每組24只，各組又隨機分為3、6、12 h時間點3個亞組，每亞組為8只大鼠。①假手術組(SO組)：開腹翻動十二指腸并觸摸胰腺3次。②AP組：制造AP模型組。③ALA組：制造AP模型成功后，于腹腔內注射ALA(1 mg/kg)。

1.5取材分別于3 h、6 h、12 h處死各組大鼠取材，下腔靜脈穿刺抽取全血2 ml用于測定血淀粉酶、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)等生化指標；取胰腺組織及楔形腎組織塊，一部分以10%甲醛固定，用于HE染色及免疫組織化學檢測。另一部分用PBS液浸潤(1∶9)后，用組織勻漿器冰浴下制成組織勻漿，4℃離心2 000 r/min 30 min，取上清液-70°保存，進行腎組織SOD、MDA及蛋白定量檢測。胰腺組織只作光鏡檢查，證實AP制模成功。

1.6檢測指標①腎組織MDA及SOD含量測定：用硫代巴比妥酸分光光度比色法測定腎組織MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量，按照說明書操作方法測定。②胰腺及腎組織HE染色：常規石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，行HE常規染色，光鏡下觀察胰腺和腎臟組織病理變化。③免疫組織化學檢測腎組織中ICAM-1及VCAM-1表達：按照SP試劑盒操作說明書進行。石蠟切片常規脫蠟、梯度酒精水化，檸檬酸鹽緩沖液微波修復，涼至室溫，經3% H2O2常溫孵育15min消除內源性過氧化物酶，再加入一抗ICAM-1抗體(PBS稀釋成1∶100)，4℃冰箱過夜，再分別加二抗和辣根過氧化物酶標記的三抗鏈霉卵白素，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水透明，中性樹脂封片。陽性對照采用已知陽性片為標準，陰性對照采用PBS代替一抗為標準。每例標本鏡下400倍隨機選取10個視野，采集圖像，應用 Image pro plus 6.0專業圖像分析軟件進行測量，以陽性細胞染色的平均光密度值(OD值)來表示抗原的相對表達量。

2結果

2.1各組大鼠血清淀粉酶的變化在3、6和12 h各時間點，SO組無明顯變化。與SO組比較，在AP組和ALA組均顯著升高(P<0.01)，且隨時間點的延長，血清淀粉酶逐漸升高。而ALA組較AP比較血清淀粉酶則明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1　AP大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN水平以及腎組織SOD活力、MDA含量測定

與SO組比較：1)P<0.05，與AP組比較：2)P<0.05，與同組3 h比較：3)P<0.05，與同組6 h比較：4)P<0.05

2.2各組大鼠腎功能的變化血清Cr與BUN在3、6和12 h各時間點，SO組無明顯變化。與SO組比較，急AP組和ALA組均顯著升高(P<0.01)，且隨時間的延長Cr、BUN升高更為明顯。與AP組比較，ALA組血清Cr、BUN水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3腎組織MDA、SOD含量的變化與SO組相比，AP組大鼠腎臟的脂質過氧化程度增高；在6 h和12 h AP組腎組織脂質過氧化產物MDA水平明顯高于SO組(P<0.01)；SOD活力則明顯低于SO組(P<0.01)；而在3 h時腎組織中各組之間MDA與SOD無差異(P>0.05)；給予ALA治療后大鼠腎臟的脂質過氧化的產物MDA較同時段AP組降低(P<0.05)，SOD增加，(P<0.05)。見表1。

2.4鏡下腎臟組織病理學變化SO組大鼠腎皮質髓質結構清晰，腎小球和腎小管及間質的結構均正常，各個時間點無明顯差別；AP組術后3 h腎小球和腎小管結構無明顯改變，腎間質可見少量中性粒細胞浸潤；6 h腎小球可見輕度淤血，腎小管上皮細胞呈明顯水樣變性，胞質疏松淡染，腎間質中性粒細胞浸潤增加，隨著時間的延長，腎臟組織損傷逐漸加重，腎近曲小管上皮細胞變性、壞死，腎小球淤血，腎間質大量炎性細胞浸潤，而ALA組僅少數上皮細胞輕度水腫，細胞界限不清，胞質內有淡粉紅色顆粒。見圖1。

2.5腎組織ICAM-1與VCAM-1蛋白免疫組織化學檢測ICAM-1與VCAM-1陽性表達定位于細胞質內，為棕黃色染色，高倍鏡下觀察呈細顆粒狀。見圖2，圖3。在SO組，腎組織中

SO組6 h　　　　　AP組6 h　　　　ALA治療組12 h 圖1　AP大鼠腎組織的病理學變化(HE，×200)

AP組3 h　　　　　　AP組12 h　　　　ALA治療組12 h 圖2　AP大鼠腎組織的ICAM-1表達(DAB,×400)

AP組6 h　　　　　　AP組12 h　　　　ALA治療組 圖3　AP大鼠腎組織的VCAM-1表達(SP,×400)

幾乎沒有ICAM-1、VCAM-1表達。AP組大鼠術后3 h ICAM-1已可見少量表達(OD值：SO組vs AP組0.07±0.00 vs 0.08±0.02)，但與SO組相比無明顯差異(P>0.05)。隨著時間的推移，AP組6 h與12 h檢測發現ICAM-1表達均明顯增加，與SO組相比其陽性細胞數明顯增多(SO組vs AP組0.05±0.00 vs 0.17±0.01；0.05±0.01 vs 0.24±0.03)(P<0.01)；ALA組同樣在3、6、12 h均可見到ICAM-1的表達，但與AP組相比，表達為明顯減弱(P<0.05)。VCAM-1的表達則出現在AP組與ALA組的6 h與12 h，且在12 h有明顯表達，與SO組相比有顯著差異(P<0.01)；與AP組相比，ALA組VCAM-1的表達呈弱陽性，兩組之間有顯著差異(P<0.05)。

3討論

AP發生后機體發生了一系列的病理變化，其中SIRS、氧化應激、內毒素血癥、微循環障礙導致全身及腎血流動力學改變等均對腎臟功能產生一定的影響〔4〕。AP時胰腺組織缺血，局部微循環紊亂，毛細血管損傷所致的胰腺血管通透性增加，缺血組織中的吞噬細胞特別是中性粒細胞聚集后產生大量的氧自由基(OFR)并激發自由基的連鎖增殖反應，導致機體內MDA含量升高，而SOD活性降低，過多的自由基可直接損傷腎小球毛細血管內皮細胞，使腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞變性、壞死，最終腎小球濾過率下降導致急性腎衰竭〔5〕；同時氧自由基還可激活核因子-κB信號傳導通路，造成細胞因子、黏附分子等過度表達〔6〕。從而介導胰腺和胰外器官血管內皮損傷、微循環障礙和血管通透性增加，引起胰腺和全身器官的功能損傷。研究總結發現腎功能損害僅次于肺損傷，且與胰腺炎的預后密切相關〔7〕。Telek等〔8〕研究顯示SAP腎損傷時腎組織的SOD和MDA與SAP腎損傷呈正相關，因此認為OFR引發的脂質過氧化反應是SAP腎損傷重要因素。ICAM-1及VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，通過識別其受體白細胞功能相關抗原-1(LFA-1)與白細胞表面配體VLA-4等可促進白細胞與血管內皮細胞的黏附及滲出，擴大炎癥反應，造成血管病變，導致組織器官發生病理生理改變而促進炎癥和免疫反應。病理情況下，它們可在病變的腎小管上皮細胞上強烈表達，為腎臟炎癥活動的主要標志。研究發現ICAM-1及VCAM-1是誘導炎性細胞向腎間質組織浸潤的主要黏附分子〔9～11〕。黏附分子在腎臟免疫性炎性損傷時，介導了單核/巨噬細胞等炎細胞在血管壁的黏附，繼而穿過血管壁向炎癥區域移行、聚集，導致和促進組織損傷。炎性細胞在腎組織的持續浸潤是腎臟炎癥反應擴大和腎功能損害的重要因素，這些炎癥因子在急性腎損傷時明顯增加,同時加重對腎小球內皮細胞和系膜細胞損傷作用〔12，13〕。國外研究發現，病理情況下，ICAM-1可在病變的腎小管上皮細胞上強烈表達，為腎臟炎癥活動的主要標志。腎缺血/再灌注損傷時，ICAM-1表達上調，導致循環白細胞在局部黏附，使內皮通透性增加，且浸潤、激活的白細胞還可導致直接的組織損傷，ICAM-1缺陷大鼠能朋顯減輕腎缺血/再灌注損傷，因此拮抗ICAM-1可減輕腎損傷〔14，15〕。總之在AP時，炎癥反應和氧化應激相互影響，參與細胞損傷過程，致炎因子和氧化應激發揮協同作用，觸發共同的信號轉導通路，導致炎癥的級聯放大，從而導致腎臟功能的損傷。本實驗結果顯示造模組大鼠可見一般狀況的改變，血肌酐、尿素氮明顯升高，MDA增高和SOD下降，免疫組化結果顯示ICAM-1與VCAM-1在AP造模組和治療組表達明顯增強，表明這兩種黏附分子可能在氧化應激與炎癥反應狀態下被激活，進一步證實了它們在AP腎損傷發展過程中的作用，與國內外研究報道相符。

ALA為一種新型抗氧化劑，是類維生素物質，有很強抗氧化活性，和其還原態二氫硫辛酸(DHLA)一起被譽為“萬能抗氧化劑”，是氧化應激的強效抑制劑，在臨床可以用于預防和治療多種疾病。在癌癥、衰老、糖尿病(DM)、動脈粥樣硬化、腦和神經組織的退化性等疾病中發揮著重要的作用，已受到國際生物醫學界的高度關注。它兼有脂溶性與水溶性有特性，能被消化道輕易吸收，可以分布到機體的各個部位發揮作用。主要作用：①可以直接清除ROS；②螫合金屬離子，降低DH的產生，阻斷脂質過氧化；③再生(還原)其他的抗氧化劑〔16～21〕。Aitken等〔22〕研究發現抗氧化劑可以通過調控GPx、硫氧蛋白還原酶等的活力來抵制ICAM-1與VCAM-1在機體內的表達，從而緩解了炎癥反應，減低了疾病的發生率與嚴重程度。代新華等〔23〕的研究則表明ALA能顯著降低DM大鼠氧化應激水平，減輕氧化應激對腎組織的損傷及炎癥反應而保護腎臟。

本實驗表明ALA對AP相關性腎損傷具有保護作用，其機制可能與抗氧化作用和抑制腎組織中ICAM-1與VCAM-1的釋放有關。

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〔2013-08-22修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)