索拉菲尼聯合紫杉醇對HepG2細胞的抑制作用及其對cyclinD1表達水平的影響

索拉菲尼聯合紫杉醇對HepG2細胞的抑制作用及其對cyclinD1表達水平的影響

孫煒宋祥和卞勇華俞敏李玉華

(鹽城衛生職業技術學院，江蘇鹽城224006)

摘要〔〕目的探討索拉菲尼(SOR)單藥、紫杉醇(PTX)單藥以及兩藥聯合對肝癌細胞株HepG2增殖的抑制作用及其對周期素依賴性蛋白cyclinD1表達的影響，探討其協同作用機制。方法以不同濃度的SOR和不同濃度的PTX，分別組成單藥組和聯合用藥組，另設不加藥的對照組，作用于HepG2細胞。MTT法檢測SOR、PTX單藥及聯用后HepG2細胞的增殖抑制率，流式細胞儀分析細胞的凋亡率；RT-PCR檢測各組細胞中cyclinD1表達。結果SOR、PTX單藥與聯用均能抑制HepG2細胞增殖，且呈明顯時間-劑量依賴效應，兩藥聯用有協同效應，可使HepG2細胞增殖率明顯下降，細胞數減少，聯合組與對應的單藥組間差異顯著(P<0.05)；藥物作用48 h后，給藥組cyclinD1 mRNA的表達較對照組明顯減少(P<0.05)，兩藥聯用cyclinD1表達更顯著，與單藥組比較有顯著差異(P<0.05)。結論SOR和PTX聯用可協同下調HepG2細胞中cyclinD1表達，增強了抑制HepG2細胞增殖及誘導其凋亡效應。

關鍵詞〔〕索拉菲尼；紫杉醇；cyclinD1；肝癌

中圖分類號〔〕R735.7〔

基金項目：鹽城市科技局科研項目(YK20113109)

通訊作者：李玉華(1963-)，男，教授，主要從事腫瘤分子機制研究。

第一作者：孫煒(1964-)，女，高級實驗師，主要從事免疫分子機制研究。

原發性肝癌(PHC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高、容易侵襲轉移，死亡率高。因此，尋找一種合理有效的治療方案具有重要的意義〔1〕。索拉非尼(SOR)是一種多激酶抑制劑，作為第1個在肝癌治療中獲得優勢生存的靶向藥物〔2〕，已被美國食品與藥品管理局(FDA)確定用于肝癌患者的治療。紫杉醇(PTX)是十分有效的抗腫瘤藥，主要機制為該藥能通過與微管蛋白相結合，阻止微管解聚，穩定已組裝好的微管的結構和促進微管組裝，致微管組裝和平衡打亂。因此在組裝過程中，紫杉醇的敏感性與周期蛋白依賴激酶(CDK)及其調節因子cyclinD1水平有關〔3，4〕。本研究探討SOR聯合PTX對人肝癌 HepG2細胞的抑制作用及其機制。

1材料與方法

1.1細胞與試劑索拉菲尼(SOR，德國拜耳公司)；用100%二甲基亞砜(DMSO，南京賽泓瑞生物科技有限公司)溶解，-20℃保存，實驗時稀釋，DMSO終濃度<0.5%。紫杉醇(PTX，江蘇楊子江制藥有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國 Sigma 公司)，用pH7.35 PBS配制成濃度為5 mg/ml。碘化丙啶(PI)試劑盒購自Sigma公司。人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2細胞培養HepG2細胞在37.5%CO2培養箱中培養，培養基為含10%新生牛血清的RPMI 1640，含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3MTT法測定SOR、PTX單藥組、SOR和PTX聯合組對HepG2細胞的抑制率試驗分組：無藥細胞對照組；SOR組：20、12、6、3 μmol/L；PTX：30、20、10、5 μg/ml；聯合組：SOR20 μmol/L+PTX30 μg/ml、SOR12 mol/L+PTX20 μg/ml、SOR6 mol/L+PTX10 μg/ml、SOR3 mol/L+PTX5 μg/ml，共分13組。取對數生長期的HepG2細胞，以7×103/孔密度接種于96孔板，每種濃度設4個復孔，每孔加200 μl，對照組加同量培養液，放入培養箱在5%CO2，37℃條件下培養24 h。加藥后培養48 h，每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續培養4 h，吸去原培養液，離心將其紫色結晶沉淀于培養板底部，去上清。加入DMS0 150 μl/孔，振蕩10 min，用酶標儀(波長490 nm)測定每個孔的OD值，計算細胞抑制率。

1.4流式細胞術檢測細胞周期實驗分組同MTT法，加藥24 h后分別收集細胞，進行細胞周期及凋亡率檢測。細胞周期檢測：0.25%胰酶消化并收集細胞，3 000 r/min離心5 min 用8 ml PBS 制備單細胞懸液，加2 ml 75%預冷乙醇，吹打均勻，置4℃固定過夜，次日4℃3 000 r /min離心5 min，吸棄乙醇，用PBS重懸2次，加入PI染液500 L，4℃避光孵育20 min，上機檢測，所得結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析；凋亡率檢測：調整細胞濃度為5×105/ml，加入Annexin V-EGFP 5 L和5 L PI，避光室溫反應15 min，上機檢測。

1.5RT-PCR檢測CyclinD1 mRNA取對數生長期細胞試驗分組：無藥細胞對照組；SOR(20 μmol/L)及PTX(30 μmol/L)單藥組；SOR+ PTX聯合組。0.25%的胰酶消化，臺盼藍染色計數后，用含10%的小牛血清，100 U ml青霉素和100 U ml 鏈霉素的 RMIP 1640 培養液制成細胞懸液，以5×104個/ml密度接種5 ml于培養瓶中，在37℃，5% CO2條件下培養；藥物處理：24 h細胞貼壁后換 RMIP1640 培養液，加入500 L藥物，在37℃，5% CO2條件下培養，細胞總RNA提取(TRIzol法)，進行反轉錄實驗并鑒定總RNA濃度和純度，進行PCR擴增所用引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)如下：上游引物：5'- GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA -3'，下游引物：5'- GCTGGAAACATGCCGGTTA -3'，擴增片段長度218 bp；β-actin內參照：上游引物： 5'- CTCGCGCTACTCTCTCTTTC -3'，下游引物 5'- CAGTCTCGATCC- CACTTAA -3'，擴增片段長度330 bp，退火溫度：58℃，分別取10 μl PCR反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V電壓)，紫外燈下觀察電泳帶，凝膠成像分析系統掃描拍照，將凝膠電泳圖像輸入美國Alpha9900凝膠分析系統，應用1-D Image Analysis Software進行表達強度分析。

1.6統計學方法采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2結果

2.1不同處理組對HepG2細胞增殖的抑制作用MTT法結果顯示，SOR和PTX單藥組、聯合組能明顯抑制人肝癌HepG2細胞的生長，呈明顯量效關系。隨給藥濃度的提高，抑制率逐漸升高，隨著藥物濃度的增大,其對細胞的抑制作用逐漸增強，SOR和PTX單藥組間無顯著差別(P>0.05)，聯合組與對應的單藥組間差別顯著(P<0.05)。見表1。

2.2流式細胞儀檢測不同組細胞凋亡率SOR和PTX單藥組及聯合用藥組與對照組相比均有顯著差異(P<0.05)；聯合組凋亡率最高，與SOR和PTX單藥組比較具有顯著差異(P<0.05)。見表1。

2.3RT-PCR檢測不同組HepG2細胞中cyclinD1 mRNA的表達見圖1。對照組，SOR組，PTX組和聯合組中cyclinD1/β-actin mRNA的比值依次為(89.00±1.03)，(56.14±1.20)，(52.03±0.87)和(28.42±0.13)，SOR和PTX單藥組、聯合組與對照組及單藥組與聯合組相比均具有顯著差異(P<0.05)。

表1　不同藥物濃度組對HepG2細胞增殖

與相應濃度單藥組比較：1)P<0.05

1～4：對照組、SOR組、PTX組及聯合組 圖1　不同藥物組HepG2細胞中cyclinD1 mRNA表達

3討論

cyclinD1是CDK激酶的調節因子，在細胞周期的G1/S期轉化過程中作為正性調節因子調控細胞周期G1期細胞增殖的關鍵蛋白，cyclinD1作為G1期細胞周期素，通過對抑癌基因蛋白pRb的調控促使細胞越過G1/S限制點進入S期，cyclinD1于G1初期開始累積，于DNA合成前達峰值，S期含量最低。已證實其過度表達與多種腫瘤細胞的旺盛分裂有關，是被公認的原癌基因〔5〕。研究已發現該基因可在多種腫瘤中發生突變，擴增和過表達，促進腫瘤的發生和發展，cyclinD1過表達與腫瘤組織學類型、分化程度、淋巴轉移狀況密切相關，過表達cyclinD1的腫瘤患者預后較差〔6，7〕，其機制可能為腫瘤細胞過表達cyclinD1，導致細胞G1期縮短，提前進入S期，使細胞周期縮短，促進細胞增殖和細胞轉化，導致細胞失控性生長，加速腫瘤的生長。

SOR是一種新型多靶點抗腫瘤藥物〔8，9〕，能夠抑制MAPK 信號傳導系統及血管內皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，Raf激酶在大部分肝細胞癌中過度表達，并且Raf/ MEK/ERK 通路能被 HBV 、HCV 感染和有絲分裂生長因子所激活。Liu等〔10〕亦證實了SOR 能夠抑制 PLC/PRF/5 和 HepG2 肝癌細胞株的Raf激酶活性，進而阻斷MEK/ERK信號傳導途徑，并可降低細胞株的cyclinD1水平，從而抑制癌細胞增殖。此外，SOR也能通過抑制 Raf/MEK/ERK 信號傳導通路降低elF4E的磷酸化水平下調bcl-2家族成員的抗凋亡蛋白MCL-1的表達，從而誘導肝癌細胞株凋亡。

PTX誘導肝癌細胞凋亡的分子機制不十分清楚，主要為PTX擾亂真核細胞質內微管系統。耿長新等〔11〕認為微管蛋白是PTX抗癌作用的靶點，微管在細胞分裂過程中形成紡錘體，對細胞的有絲分裂起重要作用。PTX選擇性地與微管蛋白亞基N -末端第31位氨基酸結合，促進微管蛋白聚合成穩定的微管并且抑制微管解聚，破壞微管系統的正常平衡，擾亂細胞有絲分裂間期細胞形態、活動性、信號傳導和細胞內物質轉運的功能，導致細胞有絲分裂的阻滯，將增殖期的腫瘤細胞阻滯在G2-M期〔12〕；Chu等〔13〕的研究表明，PTX通過磷酸化抑制凋亡的bcl-2原癌基因，使其原本抑制凋亡的作用下降，破壞了促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡，從而使細胞發生凋亡；另有研究結果：PTX通過抑制硫氧還蛋白，低氧誘導因子-1α以及cyclinDl的表達降低HepG2的活性，抑制其生長，促進凋亡〔14〕。

本實驗中發現SOR和PTX聯用明顯增強了HepG2細胞的抑制率和促進其凋亡的作用，RT-PCR檢測兩藥聯用后HepG2細胞中cyclinD1 mRNA明顯下調。因此，兩藥聯用協同作用機制可能如下：①可能協同作用抑制HepG2細胞中cyclinD1 mRNA表達，下調cyclinD1蛋白表達的信號通路，抑制cyclinD1蛋白的合成，阻滯細胞從G1期向S期分化〔5〕。②PTX促進微管蛋白聚合成穩定的微管并且抑制微管解聚，破壞微管系統的正常平衡，導致細胞有絲分裂的阻滯，將增殖期的腫瘤細胞進一步阻滯在G2-M期。③已有研究證實：PTX的耐藥機制可能與抗凋亡蛋白bcl-2及bcl-XL的過度表達存在密切關系，它們能通過抑制線粒體凋亡通路最終阻斷紫杉醇所誘導的細胞凋亡〔15〕。而SOR可以下調bcl-2家族成員的抗凋亡蛋白MCL-1的表達〔16〕，因此聯用可能對拮抗PTX產生耐藥性有一定的意義，這還有待于進一步的研究證實。

作為一種新的靶向性藥物，SOR與化療藥物聯用的多項Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗已在不同的實體腫瘤中展開〔17～19〕。本實驗結果顯示顯示：SOR和PTX聯用對肝癌細胞的抑制作用要大于單藥治療的效果。但要為臨床應用提供更為確切的理論依據，SOR聯用化療藥物治療腫瘤的最佳方案仍需進行臨床前的大量研究。

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〔2013-10-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)